本文選題：內(nèi)皮祖細胞 + 血管內(nèi)皮細胞生長因子　； 參考：《安徽醫(yī)科大學》2010年碩士論文

【摘要】： 目的：隨著人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)改變,下肢缺血性疾病已成為老年人的常見病和多發(fā)病,是截肢致殘的主要原因,已成為血管外科研究的一個難點和熱點。促進組織血管新生研究已發(fā)展成為一種治療缺血性疾病的新方法。治療性血管新生可通過三種方法得以實現(xiàn)：生長因子蛋白治療,細胞移植以及基因轉(zhuǎn)染。血管內(nèi)皮祖細胞和血管內(nèi)皮生長因子在血管形成和促血管新生的過程中起著重要作用,本研究擬將基因治療和干細胞治療方法相結(jié)合,探討人血管內(nèi)皮細胞生長因子165(hVEGF165)基因轉(zhuǎn)染人外周血內(nèi)皮祖細胞(EPCs)及對EPCs增殖和分泌VEGF和NO能力的影響。 方法：取經(jīng)過rhG-CSF動員的健康成人的外周血,采用密度梯度離心法提取單個核細胞,接種在hFN包被的培養(yǎng)板上,M199培養(yǎng)液(含F(xiàn)BS和VEGF)培養(yǎng),培養(yǎng)至第7d,對貼壁細胞進行EPCs的鑒定：(1)倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞形態(tài)；(2)激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)DiI-acLDL和FITC-UEA-I雙染色的貼壁細胞；然后對pcDNA3. 1-hVEGF165質(zhì)粒進行擴增,抽提,并利用雙酶切法及測序進行鑒定,實驗分為三組：脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-hVEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對照組。通過ELISA法和硝酸還原酶法分別測定各組上清液中VEGF和一氧化氮(NO)的含量；噻唑藍(MTT)檢測hVEGF165基因修飾對EPCs增殖的影響。 結(jié)果：FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs,發(fā)黃色熒光；脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-hVEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組EPCs培養(yǎng)基上清液中VEGF和NO表達量明顯高于其他兩組(P0.01)；VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對EPCs的增殖無明顯影響。 結(jié)論：人外周血EPCs可以成功轉(zhuǎn)染hVEGF165基因,同時能表達一定濃度的VEGF蛋白,并可促進NO的分泌,而對EPCs的活性無明顯影響。為進一步研究VEGF165基因和EPCs結(jié)合治療缺血性疾病提供實驗依據(jù)。
[Abstract]:Objective: with the aging of population and the change of dietary structure, ischemic disease of lower extremity has become a common disease and frequent disease in the elderly, which is the main cause of amputation and disability, and has become a difficult and hot spot in vascular surgery.Promoting tissue angiogenesis has developed into a new method for the treatment of ischemic diseases.Therapeutic angiogenesis can be achieved in three ways: growth factor protein therapy, cell transplantation, and gene transfection.Vascular endothelial progenitor cells (VECs) and vascular endothelial growth factors (VEGF) play an important role in angiogenesis and angiogenesis.To investigate the effect of human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF165) gene transfection on the proliferation and secretion of VEGF and no in human peripheral blood endothelial progenitor cells (EPCs).Methods: the peripheral blood of healthy adults mobilized by rhG-CSF was extracted by density gradient centrifugation. The mononuclear cells were cultured in M199 medium (including FBS and VEGF) on the hFN coated culture plate.On the 7th day of culture, the adherent cells were identified by EPCs. The adherent cells were observed under inverted microscope. The adherent cells were observed by confocal laser microscopy (DiI-acLDL and FITC-UEA-I) and then pcDNA3.The 1-hVEGF165 plasmid was amplified, extracted and identified by double enzyme digestion and sequencing. The experiment was divided into three groups: liposome-mediated pcDNA3.1-hVEGF165 plasmid transfection group (pcDNA3.1 empty plasmid transfection group) and blank control group (control group).The contents of VEGF and nitric oxide (no) in supernatant of each group were determined by ELISA method and nitrate reductase method respectively, and the effect of hVEGF165 gene modification on EPCs proliferation was detected.Results the expression of VEGF and no in the supernatant of EPCs medium in the liposome-mediated pcDNA3.1-hVEGF165 plasmid transfection group was significantly higher than that in the other two groups. The expression of VEGF and no in the supernatant of EPCs medium in the liposome-mediated pcDNA3.1-hVEGF165 plasmid transfection group was significantly higher than that in the other two groups.Conclusion: human peripheral blood EPCs can successfully transfect the hVEGF165 gene, express a certain concentration of VEGF protein, promote the secretion of no, but have no effect on the activity of EPCs.To provide experimental basis for further study on the combination of VEGF165 gene and EPCs in the treatment of ischemic diseases.
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R346

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本文編號：1731748