本文選題：Flagellin　切入點：Rapamycin　出處：《山東大學(xué)》2009年碩士論文

【摘要】： 研究目的 近年來Toll樣受體家族(Toll-like Receptor,TLRs)在機體免疫應(yīng)答中的意義受到高度關(guān)注。TLRs家族成員作為一種模式識別受體(pattern recognitionreceptor,PRR)可特異性識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs),不僅在激活天然免疫中發(fā)揮重要作用,而且還在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)獲得性免疫中具有重要意義,是連接天然免疫和獲得性免疫的重要橋梁。TLRs信號可以在自身抗原,同種抗原和異種抗原的刺激下激活。2008年最新研究發(fā)現(xiàn)小鼠心臟皮膚同種移植物的長期生存需要天然Tregs的存在,TLR9的特異激活劑CpG可以通過抑制Treg的功能和促進(jìn)Th1效應(yīng)性T細(xì)胞的分化,抑制同種移植物的存活。TLR7的激活可以促進(jìn)皮膚同種移植物的排斥;TLR4的激活阻斷了利用抗CD154單抗建立的心臟同種移植物的長期存活,阻止了CD4~+/Foxp~(3+)Treg在移植物的聚集,因此TLRs信號的激活狀態(tài)對移植物的耐受或排斥非常關(guān)鍵。 研究顯示,CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)參與多種途徑誘導(dǎo)的移植免疫耐受,Treg不僅在維持自身耐受方面發(fā)揮重要作用,而且在防治同種移植物排斥方面也有重要意義。因此如何有效擴增Treg細(xì)胞是誘導(dǎo)移植耐受的關(guān)鍵因素之一。 近來研究發(fā)現(xiàn)TLR5是唯一具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的分子,可直接間接地參與自身免疫病的發(fā)病過程。細(xì)菌鞭毛蛋白(Flagellin)是TLR5的唯一配體,Flagellin可特異識別結(jié)合TLR5,通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,介導(dǎo)機體天然免疫。以往研究表明Treg功能的調(diào)節(jié)主要是通過細(xì)胞因子或者是通過APCs細(xì)胞上共刺激分子來實現(xiàn)的,然而新的證據(jù)表明Treg可以通過TLRs直接感受外來抗原的刺激,TLR5選擇性高表達(dá)在Treg細(xì)胞上,TLR5的特異激活劑Flagellin可增強Treg對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用。2008年有研究報告體內(nèi)給予TLR5特異激活劑Flagellin,可以保護(hù)機體免受化學(xué)、細(xì)菌病毒和輻射等損害。因此如何通過TLRs調(diào)控Treg細(xì)胞活性,對于誘導(dǎo)機體免疫耐受具有重要意義。 免疫抑制藥物雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)和環(huán)孢素A(Cyclosporin A,CsA)廣泛用于器官移植后的抗移植物排斥反應(yīng),并且在實驗?zāi)Ｐ椭凶鳛檎T導(dǎo)免疫耐受的工具。近來研究報道Rapa在體外可以選擇性地擴增正常小鼠的天然CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,而不阻斷該小鼠CD4~+T細(xì)胞的擴增和活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但其確切機制尚不清楚,而CsA則可抑制TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞激活和IL-2的產(chǎn)生。提示CsA和Rapa對Treg可能有不同的作用。我們前期的研究證實Rapa和CsA體內(nèi)處理可以明顯增加同種移植受體的Treg比例,增強Foxp3的表達(dá)。但是即使體內(nèi)使用Rapa,同種移植個體中的Treg比例仍然處于較低水平。因此如何通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞活性,體內(nèi)擴增Treg細(xì)胞,更好地誘導(dǎo)同種移植耐受仍是目前亟待解決的問題。 綜上所述,迄今為止的研究表明Treg細(xì)胞具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用,TLR5的激活對某些損傷因素具有免疫保護(hù)作用,Treg細(xì)胞上TLR5/TLR7/8高表達(dá),但是同種移植狀態(tài)下,TLR5的活化狀態(tài)和活化的調(diào)節(jié)及對Treg的影響途徑、機理和信號傳導(dǎo)途徑尚不清楚。我們推測利用Flagellin刺激同種移植TLR5活化,可能在體內(nèi)擴增Treg的比例,增強Foxp3的表達(dá),從而達(dá)到形成移植耐受的目的。 本課題首先分析了同種皮膚移植急性排斥過程中TLR5和Foxp3基因的動態(tài)表達(dá)狀況,然后應(yīng)用Rapa和CsA兩種不同的免疫抑制劑對小鼠同種皮膚移植模型進(jìn)行耐受初步誘導(dǎo),研究了Rapa和CsA體內(nèi)應(yīng)用對TLR5和Foxp3基因表達(dá)的影響及與移植物生存的關(guān)系:研究了Flagellin體外處理對移植耐受模型中T細(xì)胞及相關(guān)分子TLR5、Foxp3表達(dá)影響及與Rapa和CsA是否與協(xié)同作用;探討了同種移植狀態(tài)下TLR5表達(dá)的變化及意義,探討TLR5和Foxp3表達(dá)的相關(guān)性,旨在闡明Rapa、CsA及Flagellin在同種移植耐受狀態(tài)下,是否能夠通過激活TLR5,增強Treg的活性,強化免疫耐受的誘導(dǎo),為利用TLR5特異配體-Flagellin和抗排斥藥物Rapa、CsA聯(lián)合進(jìn)行同種移植耐受誘導(dǎo)奠定實驗基礎(chǔ),為CD4~+CD25~+Treg體外擴增和應(yīng)用于臨床防治同種移植排斥反應(yīng)探索新的途徑。 實驗方法 1.Flagellin的提取和鑒定:利用LB營養(yǎng)培養(yǎng)基擴增甲型副傷寒桿菌,用PBS離心后洗滌按照文獻(xiàn)[25]方法分離粗制鞭毛蛋白(Flagellin),然后通過Sephacryl S-200凝膠柱分離不同分子量的蛋白質(zhì),通過SDS-PAGE觀察并收集目的蛋白(Flagellin),透析過夜,然后利用抗Flagellin抗體,通過Western Blot檢測目的蛋白的特異性。純化的Flagellin溶液經(jīng)紫外分光光度儀測光密度00_(260)、OD_(280)值,按照公式計算蛋白含量,置—20℃儲存。 2.體內(nèi)實驗:以B6小鼠為供體,BABL/c小鼠為受體,建立小鼠同種皮膚移植模型。移植后第1天BABL/c小鼠分別給予Rapa(1.5mg/kg)或CsA(10mg/kg)及生理鹽水腹腔注射進(jìn)行耐受誘導(dǎo),每日1次,連續(xù)14日。移植后第1、7、10、14、21天,分別取實驗組及對照組小鼠脾臟及移植部位的皮片,采用異硫基氫酸胍(TRIzol)一步法提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴增,以GAPDH作為對照,檢測TLR5及Foxp3mRNA的相對表達(dá)量。 3.體外實驗:分離純化同種移植后第10天的小鼠脾T細(xì)胞,加入不同濃度的Flagellin處理3、6、12h后測定TLR5和Foxp3 mRNA的表達(dá)量,探討Flagellin作用的最佳濃度及時間;進(jìn)而在移植后第10天,提取耐受誘導(dǎo)的BABL/c小鼠脾細(xì)胞(術(shù)后第14天對照組移植皮片全部排斥)T細(xì)胞,經(jīng)不同濃度Flagellin、Rapa、CsA體外處理后,RT-PCR檢測TLR5及Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量。同時選擇未行移植術(shù)的正常BALB/c小鼠T細(xì)胞,經(jīng)不同濃度Flagellin、Rapa、CsA體外處理后,檢測TLR5及Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量。 實驗結(jié)果 1.SDS-PAGE顯示在分子量為52kD處有目的蛋白條帶,Western Blot結(jié)果顯示抗鞭毛抗體染色呈陽性。表明鞭毛蛋白提取成功。提取的蛋白濃度為75.03μg/ml。 2.與生理鹽水對照組(12.8±1.6d)相比,同種移植后體內(nèi)應(yīng)用CsA(22.0±1.9d)或Rapa(23.8±2.1d)均可明顯延長移植皮片的存活期(p＜0.05)。Rapa處理組與CsA處理組相比,延長移植物存活的能力無明顯差別,但Rapa處理組小鼠生存狀態(tài)比CsA處理組更佳。 3.對照組同種移植后TLR5和Foxp3的表達(dá)均在排斥高峰期(移植后第10d)升高最明顯,之后Foxp3的表達(dá)迅速下降,而TLR5的表達(dá)持續(xù)到移植后14d才開始下降。小鼠皮片急性移植排斥期1、7、10、14、21天,移植受體脾細(xì)胞的TLR5與Foxp3變化趨勢明顯正相關(guān)。 4.體內(nèi)給予CsA后,TLR5和Foxp3的表達(dá)第7天就明顯升高,第10天達(dá)到高峰,Foxp3在第14天恢復(fù)至起始水平,而TLR5在第21天恢復(fù)至起始水平;與對照組相比,在同種皮片移植后1、7、10、14、21天,Rapa體內(nèi)處理組脾細(xì)胞TLR5 mRNA表達(dá)明顯上調(diào);TLR5表達(dá)量較CsA組和對照組明顯增多,且停藥后,第21天表達(dá)量仍明顯高于CsA組和對照組。而Foxp3的表達(dá)的變化與CsA組無顯著變化。 5.體外實驗證明:1)Flagellin、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促進(jìn)正常BABL/c小鼠T細(xì)胞的TLR5 mRNA明顯高表達(dá)(p＜0.05),其中Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組增高更明顯,而單獨用CsA處理組與未處理組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。Flagellin處理組、Rapa組、Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組、Flagellin+CsA聯(lián)合處理組的Foxp3 mRNA均明顯高表達(dá)(p＜0.05),其中Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組的變化最明顯。單獨使用CsA處理組與未處理組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。2)經(jīng)不同濃度Flagellin處理急性排斥期小鼠T細(xì)胞不同時間后發(fā)現(xiàn),TLR5 mRNA在Flagellin濃度100ng/ml,培養(yǎng)6h表達(dá)最高。Foxp3mRNA在Flagellin濃度1000ng/ml,培養(yǎng)6h表達(dá)最高,且在所研究的各時間點,Flagellin均能促進(jìn)Foxp3表達(dá)。3)Flagellin、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促進(jìn)急性排斥期BABL/c小鼠T細(xì)胞的TLR5 mRNA表達(dá),其中Flagellin+Rapa聯(lián)合組增高更明顯,而單獨用CsA或Rapa處理組的TLR5 mRNA表達(dá)無顯著改變。Flagellin、CsA、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA聯(lián)合處理均可促進(jìn)Foxp3 mRNA表達(dá),其中Flagellin+Rapa聯(lián)合處理組增高更明顯。 結(jié)論 1.體內(nèi)應(yīng)用Rapa或CsA均可明顯延長同種移植皮片的存活時間,Rapa在抑制移植物排斥、改善宿主生存狀態(tài)方面效果明顯優(yōu)于CsA。 2.同種移植急性排斥高峰期,TLR5和Foxp3表達(dá)升高,Rapa可以明顯增強同種移植排斥期TLR5與Foxp3的表達(dá),尤其是使Foxp3表達(dá)持續(xù)升高,CsA也可促進(jìn)這兩種基因的表達(dá),但持續(xù)時間較短。 3.成功提取甲型副傷寒桿菌的鞭毛蛋白并進(jìn)行了初步鑒定。 4.Rapa在體外可促進(jìn)移植耐受模型T細(xì)胞的TLR5和Foxp3的基因表達(dá),Flagellin可以協(xié)同增強Rapa這一作用。CsA可促進(jìn)排斥高峰期T細(xì)胞Foxp3表達(dá),但對TLR5表達(dá)無明顯影響,與Flagellin無協(xié)同作用。Flagellin體外可以促進(jìn)排斥高峰期T細(xì)胞TLR5和Foxp3的表達(dá),并增強Rapa的作用效果。 5.Rapa和Flagellin體外均可促進(jìn)正常小鼠脾T細(xì)胞的TLR5和Foxp3的表達(dá),且相互具有協(xié)同作用。CsA對正常小鼠T細(xì)胞的TLR5和Foxp3的表達(dá)無明顯作用。
[Abstract]:Purpose of study



TLRs family members act as a pattern recognition receptor ( PRR ) to specifically identify pathogen - associated molecular patterns ( PAMPs ) .



It is shown that CD4 ~ + CD25 ~ + regulatory T cells ( Treg ) are involved in various pathway - induced graft immune tolerance , and Treg plays an important role in maintaining self - tolerance , but also plays an important role in preventing and treating allograft rejection . So how to effectively amplify Treg cells is one of the key factors in inducing graft tolerance .



TLR5 is the only ligand of TLR5 , and Flagellin can specifically recognize and bind TLR5 to stimulate the production of cytokines such as TNF - 偽 , IL - 1尾 , IL - 8 . The specific activator of TLR5 can enhance the inhibitory effect of Treg on effector T cells .



It was suggested that Rapa and CsA could significantly increase the proportion of CD4 ~ + CD25 ~ + regulatory T cells in normal mice without blocking the proliferation and activation of CD4 ~ + T cells .



In conclusion , the study has shown that Treg cells have immunoprotective effect on Treg cells , and TLR5 / TLR7 / 8 is highly expressed in Treg cells . However , the activation status and activation of TLR5 and the pathways , mechanisms and signal transduction pathways of TLR5 are not clear in the same transplantation state . We suggest that Flagellin may be used to stimulate the activation of TLR5 and increase the expression of Foxp3 in vivo , so as to achieve the purpose of transplantation tolerance .



In this study , the expression of TLR5 and Foxp3 genes in mice with acute rejection was studied . The effects of Rapa and CsA on the expression of TLR5 and Foxp3 gene were studied . The relationship between TLR5 and Foxp3 gene expression was studied .



experimental method



1 . Isolation and identification of Flagellin : Using LB nutrient medium to amplify the paratyphoid A , the crude flagellin was isolated by centrifugation with PBS . The proteins with different molecular weights were separated by Sephacryl S - 200 gel column . The specific protein content was detected by Western Blot . The purified Flagellin solution was measured by UV spectrophotometry at 00 _ ( 260 ) and OD _ ( 280 ) . The protein content was calculated according to the formula , and then stored at -20 鈩，

本文編號：1730627