本文選題：血管平滑肌細(xì)胞　切入點(diǎn)：分化　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)異常增殖是許多血管增殖性疾病,如動脈粥樣硬化、血管再狹窄、高血壓等發(fā)生發(fā)展的共同病理學(xué)基礎(chǔ)。既往研究已經(jīng)證明,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)作為多肽生長因子家族中的一員,通過與受體TβRI/TβRII(TGF-βtype I receptor,TβRI;TGF-βtype II receptor,TβRII)相互作用而發(fā)揮對細(xì)胞生長、分化和凋亡的調(diào)節(jié)作用。闡明TGF-β在VSMC生物學(xué)行為調(diào)節(jié)中的作用及其機(jī)制,對防治血管重塑和逆轉(zhuǎn)增殖性血管病變具有重要的意義。 Krüppel樣因子(krüppel-like factor,KLF)是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,其典型結(jié)構(gòu)特征是在羧基端具有3個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。KLF廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及胚胎發(fā)育等生命活動的調(diào)控。近年來的研究結(jié)果顯示,KLF4(krüppel-like factor 4)作為轉(zhuǎn)錄因子既可直接結(jié)合DNA,又能通過與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用而調(diào)控基因的表達(dá)。以往研究證實(shí),TGF-β1可誘導(dǎo)KLF4表達(dá)并促進(jìn)體外培養(yǎng)的去分化型VSMC進(jìn)行分化,但KLF4在TGF-β誘導(dǎo)VSMC分化中的作用及機(jī)制尚不清楚。 為了闡明KLF4在TGF-β誘導(dǎo)VSMC分化中的作用及其分子機(jī)制,本文在系統(tǒng)研究TGF-β1對VSMC增殖、分化、遷移、細(xì)胞周期等生物學(xué)行為影響的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討KLF4在TGF-β1促進(jìn)VSMC分化中的作用和分子機(jī)制。旨在為揭示動脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù),為心血管疾病的防治提供新的靶點(diǎn)。 1. TGF-β1誘導(dǎo)VSMC分化與上調(diào)KLF4和TβRI表達(dá)有關(guān) 本部分實(shí)驗(yàn)以VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)水平作為判斷VSMC表型的指標(biāo),檢測TGF-β1對VSMC表型及相關(guān)生物學(xué)行為的影響。為了考察TβRI是否參與TGF-β1誘導(dǎo)VSMC分化的過程,一方面,觀察敲減TβRI基因表達(dá)對VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響;另一方面,觀察KLF4過表達(dá)和敲減對TβRI表達(dá)以及對VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 1.1 TGF-β1抑制VSMC增殖、遷移和細(xì)胞周期進(jìn)程 MTT分析、細(xì)胞計(jì)數(shù)、傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TGF-β1能以濃度(0.5、1、2、4 ng/ml)和時間(24、48 h)依賴的方式抑制VSMC增殖和遷移,以TGF-β1濃度為2 ng/ml作用于VSMC 48 h對細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用最強(qiáng)。 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,TGF-β1能以時間(6、12、24、48 h)依賴的方式抑制VSMC細(xì)胞周期的進(jìn)程。TGF-β1(2 ng/ml)刺激VSMC 48 h后,停滯于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)顯著增加,同時處于S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯減少。 1.2 TGF-β1誘導(dǎo)VSMC分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin表達(dá) SM22α和SMα-actin表達(dá)是VSMC處于分化狀態(tài)的重要分子標(biāo)志, PCNA表達(dá)是VSMC處于增殖狀態(tài)的重要標(biāo)志。采用Western blot方法,檢查TGF-β1對各種標(biāo)志基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,在TGF-β1處理的VSMC中,分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin表達(dá)明顯升高,而增殖標(biāo)志物PCNA表達(dá)顯著降低,這些基因的表達(dá)變化依賴于TGF-β1作用的時間和濃度。其中,濃度為2 ng/ml和作用時間為48 h時變化最為顯著。 1.3敲減TβRI表達(dá)對VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響 將靶向TβRI的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)導(dǎo)入VSMC,阻斷內(nèi)源性TβRI表達(dá)后,研究TβRI在TGF-β1誘導(dǎo)VSMC分化中的作用。Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染TβRI-siRNA可使TβRI mRNA和蛋白表達(dá)水平降低約75~80%,表明該基因的表達(dá)被有效敲低。在TGF-β1刺激下,轉(zhuǎn)染TβRI-siRNA的VSMC中SM22α和SMα-actin的表達(dá)明顯降低,相反,增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)顯著增加。 1.4 KLF4在TGF-β1誘導(dǎo)TβRI表達(dá)及VSMC分化中的作用 雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KLF4是參與細(xì)胞生長、分化和凋亡的調(diào)控,但KLF4是否通過TβRI介導(dǎo)TGF-β1的作用目前尚不清楚。 RT-PCR和Western blot結(jié)果表明,TGF-β1顯著誘導(dǎo)KLF4和TβRI基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),并具有明顯的時-效(6、12、24、48 h)關(guān)系。2 ng/ml TGF-β1作用于VSMC 6 h后,KLF4和TβRI的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高,兩者的表達(dá)變化呈正相關(guān)關(guān)系。 為了闡明KLF4與TβRI表達(dá)之間的關(guān)系,將KLF4-siRNA導(dǎo)入VSMC,阻斷內(nèi)源性KLF4表達(dá)后,明確KLF4在TGF-β1誘導(dǎo)TβRI及VSMC分化標(biāo)志基因表達(dá)中的作用。RT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染KLF4-siRNA可敲減KLF4表達(dá)60%以上。在敲低KLF4表達(dá)的VSMC中,TGF-β1誘導(dǎo)TβRI表達(dá)的作用被取消,分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin的表達(dá)也明顯下降,表明KLF4介導(dǎo)TGF-β1對TβRI表達(dá)的誘導(dǎo)作用。 另外,將KLF4腺病毒表達(dá)載體Ad-KLF4感染VSMC,觀察強(qiáng)制表達(dá)KLF4對TβRI和VSMC分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響。RT-PCR和Western blot分析證實(shí),在KLF4過表達(dá)的VSMC中,TβRI表達(dá)明顯高于空載體對照組,與此同時,分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin的表達(dá)也顯著升高。 2. TGF-β1通過激活Smad和p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)KLF4磷酸化和KLF4與Smad2/3相互作用 TGF-β1通過與VSMC上的相應(yīng)受體相互作用而觸發(fā)細(xì)胞信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而活化Smad信號通路而激活相關(guān)基因表達(dá)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)反應(yīng)是胞內(nèi)信號進(jìn)行交互作用的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在上述闡明KLF4通過TβRI介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)VSMC分化的基礎(chǔ)上,本部分實(shí)驗(yàn)探討TGF-β1對Smad和MAPK信號途徑的影響,以期闡明TGF-β1誘導(dǎo)KLF4活化和促進(jìn)細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 2.1 TGF-β1通過激活Smad和p38 MAPK信號途徑誘導(dǎo)KLF4磷酸化 VSMC經(jīng)TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min,用磷酸化絲氨酸抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀后檢測磷酸化KLF4的水平。結(jié)果顯示,隨著TGF-β1刺激時間的延長,磷酸化型KLF4水平逐漸升高,在TGF-β1刺激20~40 min內(nèi),其磷酸化水平增加2倍;同時,TGF-β1刺激后,磷酸化型Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)和p38 MAPK(p-p38)水平也顯著升高。 分別以TβRI特異性抑制劑SB431542、p38特異性抑制劑SB203580和ERK特異性抑制劑PD98059處理VSMC,特異性阻斷Smad、p38或ERK信號通路的活化后,再以2 ng/ml的TGF-β1刺激細(xì)胞40 min。Western blot結(jié)果顯示,SB431542或SB203580預(yù)處理細(xì)胞可顯著抑制KLF4磷酸化,而PD98059對KLF4磷酸化無明顯影響。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低內(nèi)源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表達(dá)后,TGF-β1對KLF4磷酸化不再產(chǎn)生明顯影響。證明TGF-β1誘導(dǎo)的KLF4磷酸化依賴于Smad和p38 MAPK信號途徑的激活。 2.2 TGF-β1通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化而促進(jìn)KLF4與Smad2/3相互作用 免疫共沉淀分析結(jié)果顯示,VSMC被TGF-β1處理后,KLF4與Smad2/3相互作用形成的復(fù)合物明顯增加。VSMC在TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min后,隨著刺激時間的延長,KLF4與Smad2/3的結(jié)合明顯增加,交互免疫沉淀也得到相似的結(jié)果。表明,TGF-β1能顯著促進(jìn)KLF4與Smad2/3的相互作用,并具有明顯的時效關(guān)系。 為了檢查KLF4磷酸化是否影響其與Smad2/3的相互作用,以SB431542、SB203580和PD98059處理VSMC,特異性阻斷Smad、p38或ERK信號通路的活化后,再以2 ng/ml TGF-β1刺激細(xì)胞40 min。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示,在SB431542和SB203580預(yù)孵育的VSMC中,KLF4與Smad2/3的相互作用明顯降低,交互免疫沉淀得到相似的結(jié)果。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低內(nèi)源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表達(dá)后,TGF-β1對KLF4與Smad2/3的相互作用不再產(chǎn)生明顯影響。上述結(jié)果表明,TGF-β1通過Smad和p38 MAPK信號途徑誘導(dǎo)KLF4發(fā)生磷酸化修飾,而磷酸化型KLF4與Smad2/3的結(jié)合活性明顯增加。 KLF4磷酸化位點(diǎn)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證明,轉(zhuǎn)染KLF4磷酸化位點(diǎn)(S470A)突變體的細(xì)胞再用TGF-β1處理時,KLF4的磷酸化水平明顯降低,KLF4與Smad2/3的相互作用較對照組(轉(zhuǎn)染野生型KLF4表達(dá)載體)降低。這些結(jié)果進(jìn)一步提示,TGF-β1通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化而促進(jìn)KLF4與Smad2/3之間的相互作用。 2.3 KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI基因表達(dá) 上述實(shí)驗(yàn)證實(shí),TGF-β1促進(jìn)KLF4與Smad2/3相互作用。為了檢查KLF4與Smad2/3相互作用在調(diào)節(jié)TβRI表達(dá)中的意義,我們首先進(jìn)行了報告基因分析。將TβRI啟動子指導(dǎo)的報告基因分別與KLF4或Smad2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞時,KLF4和Smad2均能促進(jìn)TβRI啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。KLF4和Smad2共轉(zhuǎn)染使TβRI啟動子活性比轉(zhuǎn)染其中一種表達(dá)質(zhì)粒升高1倍左右。表明KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI基因表達(dá)。 為了進(jìn)一步檢查TGF-β1對KLF4與Smad2相互作用的影響,用KLF4和Smad2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后,再以2 ng/ml TGF-β1刺激細(xì)胞40 min。報告基因分析結(jié)果顯示,TGF-β1處理可增加KLF4與Smad2相互作用及其對TβRI啟動子的激活作用。Smad和p38 MAPK抑制劑能有效阻斷TGF-β1對TβRI啟動子的激活。這些結(jié)果表明,TGF-β1通過激活Smad和p38 MAPK信號通路而促進(jìn)KLF4與Smad2/3的相互作用及其對TβRI啟動子的反式激活功能。 3. KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI啟動子的作用機(jī)制 對TβRI基因啟動子區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析的結(jié)果表明,TβRI啟動子區(qū)存在KLF4(CACCC)和Smad(CAGAC)結(jié)合位點(diǎn)。本部分實(shí)驗(yàn)研究KLF4和Smad2與其結(jié)合位點(diǎn)的相互作用,進(jìn)一步揭示KLF4和Smad2對TβRI基因表達(dá)的調(diào)控方式。 3.1 KLF4直接結(jié)合于TβRI啟動子區(qū)的CACCC元件上并激活TβRI基因轉(zhuǎn)錄 TβRI啟動子指導(dǎo)的報告基因分析結(jié)果顯示,KLF4以劑量依賴的方式增強(qiáng)TβRI啟動子的活性。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)結(jié)果顯示,內(nèi)源性和外源性的KLF4均可結(jié)合到TβRI啟動子上。缺失TβRI啟動子區(qū)的KLF4結(jié)合位點(diǎn)及突變KLF4結(jié)合位點(diǎn)后進(jìn)行報告基因分析的結(jié)果表明,KLF4通過與TβRI啟動子近端的兩個KLF4結(jié)合位點(diǎn):即KLF4結(jié)合位點(diǎn)2(-402~-398,CACCC)和位點(diǎn)3(-343~-339,CACCC)相互作用而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。Oligo pull-down分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),KLF4直接結(jié)合于TβRI啟動子區(qū)的KLF4結(jié)合位點(diǎn)2和3上。 3.2 Smad2在TGF-β1誘導(dǎo)TβRI表達(dá)中的作用 Smad是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員。上述研究結(jié)果表明,KLF4可直接激活TβRI基因的表達(dá),但與KLF4相互作用的Smad2和Smad3是否影響TβRI基因的表達(dá),目前尚不清楚。 本部分實(shí)驗(yàn)將靶向Smad2或Smad3的siRNA導(dǎo)入VSMC,阻斷內(nèi)源性Smad2或Smad3的表達(dá)后,檢查Smad2或Smad3在TGF-β1誘導(dǎo)TβRI表達(dá)中的作用。Western blot分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Smad2或Smad3的siRNA在敲低Smad2或Smad3表達(dá)的同時,也顯著降低TβRI基因的表達(dá)。以Smad2表達(dá)載體pcDNA3.0-Smad2轉(zhuǎn)染VSMC,證實(shí)Smad2在VSMC中的過表達(dá)能顯著上調(diào)TβRI的表達(dá)。這些結(jié)果提示,Smad2和Smad3與TβRI的表達(dá)呈正相關(guān)。 3.3 Smad2通過與TβRI啟動子區(qū)的Smad結(jié)合元件相互作用而激活基因表達(dá) TβRI啟動子指導(dǎo)的報告基因分析結(jié)果表明,Smad2也能以劑量依賴性方式增強(qiáng)TβRI啟動子的活性。ChIP分析結(jié)果顯示,在用Smad2抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中可以擴(kuò)增得到TβRI基因啟動子區(qū)的Smad(-806~-561)結(jié)合區(qū)域,TGF-β1處理使Smad2與DNA的結(jié)合顯著增加。為了定位TβRI啟動子區(qū)的Smad2結(jié)合元件,進(jìn)一步對截短的TβRI啟動子進(jìn)行報告基因分析。結(jié)果表明,Smad2只能激活含TβRI轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-993bp的TβRI啟動子,不能激活截短的、缺失-806~-561核苷酸序列的TβRI啟動子。結(jié)果提示,Smad結(jié)合元件位于TβRI啟動子區(qū)的-806~-561區(qū)域。 3.4 KLF4與預(yù)先結(jié)合在Smad結(jié)合位點(diǎn)上的Smad2協(xié)同激活TβRI基因轉(zhuǎn)錄 交互ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在用KLF4抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中既能擴(kuò)增得到TβRI基因啟動子區(qū)的KLF4結(jié)合序列(-483~-241),又能擴(kuò)增得到Smad結(jié)合序列(-806~-561),而在Smad2抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中,只能擴(kuò)增到TβRI基因啟動子區(qū)的Smad結(jié)合序列,不能擴(kuò)增得到KLF4的結(jié)合序列。這些結(jié)果表明,KLF4-Smad2復(fù)合物位于Smad結(jié)合區(qū)。連續(xù)ChIP分析進(jìn)一步顯示,在用Smad2抗體再次沉淀KLF4抗體沉淀得到的染色質(zhì)片段時,二次沉淀物中仍能擴(kuò)增得到Smad結(jié)合序列。以上結(jié)果再次表明,KLF4與Smad2在TβRI基因啟動子的Smad結(jié)合區(qū)形成復(fù)合物。 為了進(jìn)一步證實(shí)在Smad結(jié)合區(qū)形成的KLF4-Smad2復(fù)合物能協(xié)同激活TβRI基因的轉(zhuǎn)錄,對缺失KLF4或Smad2結(jié)合位點(diǎn)的TβRI啟動子進(jìn)行報告基因分析。結(jié)果表明,缺失Smad結(jié)合區(qū)域(-806~-561)后,Smad2的轉(zhuǎn)錄激活作用以及Smad2和KLF4的協(xié)同激活作用消失。用Smad2-siRNA靶向敲低Smad2表達(dá)后進(jìn)行報告基因分析的結(jié)果表明,敲低Smad2的表達(dá)也消弱了KLF4的轉(zhuǎn)錄激活作用,說明KLF4的激活作用部分依賴于與Smad結(jié)合區(qū)結(jié)合的Smad2。以上結(jié)果表明,KLF4與Smad2在Smad結(jié)合區(qū)形成復(fù)合物協(xié)同激活TβRI基因的轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論 1. TGF-β1通過KLF4介導(dǎo)的TβRI表達(dá)抑制血管平滑肌細(xì)胞周期的進(jìn)程并促進(jìn)分化。 2. TGF-β1通過激活Smad和p38 MAPK信號途徑誘導(dǎo)KLF4的磷酸化,磷酸化型KLF4與Smad2/3的相互作用增強(qiáng)。 3. KLF4直接結(jié)合于TβRI啟動子區(qū)KLF4結(jié)合位點(diǎn)2(-402~-398,CACCC)和結(jié)合位點(diǎn)3(-343~-339,CACCC)并轉(zhuǎn)錄激活TβRI基因的表達(dá),Smad2通過與Smad結(jié)合元件相互作用激活TβRI基因的表達(dá)。 4. KLF4與預(yù)先結(jié)合在Smad結(jié)合元件上的Smad2形成復(fù)合物,協(xié)同激活TβRI基因的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 許立軍;鐘隆飛;單玉喜;薛波新;陳崠;;大鼠陰莖海綿體肌源性干細(xì)胞的分離及鑒定[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年14期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 程穎;葛根素促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞源工作心肌細(xì)胞的分化及其調(diào)控機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李陽;快和慢骨骼肌差異表達(dá)基因的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

，

本文編號：1729573