發(fā)布時(shí)間：2018-04-10 03:36

  本文選題：Cx43　切入點(diǎn)：醛固酮　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：研究背景 醛固酮作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)主要的效應(yīng)分子,在慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。研究表明,醛固酮可以通過它的基因組和非基因組效應(yīng)促進(jìn)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管收縮和重塑、纖維化、以及細(xì)胞增殖、變形和分化而介導(dǎo)CKD的發(fā)生和發(fā)展。此外,系膜細(xì)胞病理性增殖及系膜基質(zhì)的增多是腎小球腎炎中最常見的病理改變。因此,探明醛固酮調(diào)控腎臟系膜細(xì)胞增殖的可能機(jī)制,可能是臨床尋找新的系膜增殖性相關(guān)腎病治療策略以及延緩CKD進(jìn)展的關(guān)鍵。 隨著間隙連接蛋白在腎臟組織中被檢出及其在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中的重要作用越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn),這為我們研究醛固酮調(diào)控腎臟系膜細(xì)胞增殖提供了新的思路。間隙連接蛋白是多基因編碼的跨膜蛋白,其構(gòu)成的細(xì)胞間隙連接通道可在細(xì)胞間介導(dǎo)分子質(zhì)量低于lkd的離子或小分子物質(zhì)如金屬離子、第二信使及其他小分子代謝產(chǎn)物通過,在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),尤其是控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等方面起著重要作用。在眾多間隙連接蛋白中,Cx43是分布最廣、研究最多的分子。Cx43對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控主要通過兩種方式實(shí)現(xiàn)：通道依賴性與非通道依賴性機(jī)制：前者是指它通過參與間隙連接通道形成來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng),細(xì)胞間隙連接通訊功能異常時(shí)常常伴隨細(xì)胞的異常生長(zhǎng)；后者主要是指它可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng),與細(xì)胞間隙連接通訊功能無(wú)關(guān)。因此,本研究擬在探討Cx43是否介導(dǎo)醛固酮引起的系膜細(xì)胞增殖,并且這種介導(dǎo)作用是否與細(xì)胞間隙連接通訊功能改變有關(guān),以及醛固酮和Cx43之間調(diào)控的機(jī)制又如何。通過對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖可能的分子生物學(xué)機(jī)制的研究旨在為臨床治療系膜增殖性相關(guān)腎病提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 研究方法 1、用3H-TdR摻入法觀察不同濃度醛固酮(0.1、1、10、100nM)對(duì)大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響以及鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑螺內(nèi)酯(10nM)、不同信號(hào)通路抑制劑：ERKl/2通路-PD98059(10μM)、PI3K通路--LY294002(10μM)、PKC通路--GF109203X(10μM)對(duì)醛固酮(100nM)誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖情況的影響； 2、RT-PCR法測(cè)定不同濃度醛固酮對(duì)系膜細(xì)胞Cx43基因表達(dá)的影響以及鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑、不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)醛固酮(100nM)誘導(dǎo)的Cx43基因表達(dá)變化的影響； 3、Western blot法測(cè)定不同濃度醛固酮對(duì)系膜細(xì)胞Cx43總蛋白表達(dá)的影響以及鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑、不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)醛固酮(100nM)誘導(dǎo)的Cx43蛋白表達(dá)變化的影響； 4、Western blot法測(cè)定不同濃度蛋白酶體抑制劑MG132(0.5、1、5、10μM)對(duì)Cx43表達(dá)的影響并確定提高Cx43表達(dá)的理想刺激濃度,聯(lián)合3H-TdR摻入法測(cè)定提高Cx43表達(dá)的前提下,醛固酮促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖能力的變化。 5、Lucifer Yellow劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)(scrape loading and dye transfer,SLDT)觀察不同濃度醛固酮對(duì)細(xì)胞間隙連接通訊功能的影響。 6、激光共聚焦顯微術(shù)結(jié)合Fura-3染色法,測(cè)定不同濃度醛固酮對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子([Ca2+]i)的影響。 研究結(jié)果 l、3H-TdR摻入法結(jié)果顯示：醛固酮在0.1nM至100nM濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性地促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖(P0.05)；鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑螺內(nèi)酯、不同信號(hào)通路抑制劑：ERK1/2通路--PD98059、PI3K通路--LY294002、PKC通路-GF109203X均可不同程度地阻斷醛固酮對(duì)系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(P0.01),但各種抑制劑單獨(dú)作用時(shí)對(duì)正常系膜細(xì)胞無(wú)明顯影響(P0.05)。 2、RT-PCR結(jié)果顯示：將對(duì)照組mRNA水平設(shè)為1,醛固酮濃度從0.1nM(0.90±0.02,P0.05)至100nnM(0.32±0.03,P0.01)呈濃度依賴性降低系膜細(xì)胞Cx43的mRNA相對(duì)表達(dá)量。各種阻斷劑：螺內(nèi)酯(0.92±0.02) PD98059(0.78±0.03).GF109203X(0.67±0.04)均能夠阻斷醛固酮對(duì)系膜細(xì)胞Cx43mRNA的下調(diào)作用(P0.01),而LY294002(0.28±0.03)對(duì)100nnM醛固酮誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞Cx43mRNA的下調(diào)無(wú)明顯改善作用(P0.05)。此外,各種阻斷劑單獨(dú)作用時(shí)對(duì)正常系膜細(xì)胞Cx43mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響(P0.05)。 3、Western blot結(jié)果顯示：醛固酮從O.1n M(0.91±0.02,P0.05)至100nM(0.43±0.02,P0.01)呈濃度依賴性減少系膜細(xì)胞Cx43總蛋白的合成。各種阻斷劑：螺內(nèi)酯(0.88±0.03).PD98059(0.69±0.05)、GF109203X (0.54±0.03)均能夠阻斷醛固酮對(duì)系膜細(xì)胞Cx43總蛋白的下調(diào)作用(P0.01),而LY294002(0.33±0.04)對(duì)100nM醛固酮誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞Cx43總蛋白的下調(diào)無(wú)明顯改善作用(P0.05)。此外,各種阻斷劑單獨(dú)作用時(shí)對(duì)正常系膜細(xì)胞Cx43總蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響(P0.05)。 4、Westem blot聯(lián)合3H-TdR摻入法結(jié)果顯示：MG132從0.5μM至10μM呈濃度依賴性誘導(dǎo)系膜細(xì)胞Cx43總蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(P0.01),且在濃度為5μM即可明顯地上調(diào)Cx43總蛋白表達(dá)；將5pM MG132聯(lián)合不同濃度醛固酮共同孵育系膜細(xì)胞24h發(fā)現(xiàn),聯(lián)合刺激組與相應(yīng)濃度的醛固酮單獨(dú)刺激組相比,系膜細(xì)胞增殖能力均有不同程度地降低(P0.05)。 5、SLDT功能檢測(cè)結(jié)果示：不同濃度的醛固酮對(duì)細(xì)胞間隙連接通訊功能的影響,與正常系膜細(xì)胞相比,無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 6、激光共聚焦顯微術(shù)結(jié)合Fura-3染色法,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子([Ca2+]i)濃度結(jié)果示：醛固酮呈濃度依賴性提高系膜細(xì)胞[Ca2+]i濃度：正常組(21.62±1.90)；0.1nM Aldo(29.92±1.87,p0.05)；lnMAldo(37.20±2.1,p0.01)；10nM Aldo(57.61±1.82,p0.01)；100nMAldo (74.80±1.60,p0.01)。 研究結(jié)論 醛固酮促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖的可能機(jī)制之一是通過它的基因組效應(yīng)從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平降低Cx43的基因和蛋白質(zhì)表達(dá),而非通過影響細(xì)胞間隙連接通訊功能實(shí)現(xiàn)的,且這一過程與鹽皮質(zhì)激素受體的介導(dǎo)以及ERK1/2、PKC通路而非PI3K通路的參與密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R-332;R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馮偉靜;張愛華;丁桂霞;;活性氧依賴的表皮生長(zhǎng)因子受體磷酸化參與醛固酮誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶活化[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2010年17期

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本文編號(hào)：1729518