本文選題：變態(tài)反應(yīng)　切入點(diǎn)：肥大細(xì)胞　出處：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?肥大細(xì)胞主要存在于粘膜和結(jié)締組織中,借助于其表面表達(dá)的IgE的高親合力受體FcεRI與抗變應(yīng)原的特異性抗體IgE的交聯(lián),形成IgE/FcsRI復(fù)合物,進(jìn)而引發(fā)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。肥大細(xì)胞胞漿中存在大量顆粒,其內(nèi)儲(chǔ)存組胺等生物介質(zhì),活化的肥大細(xì)胞也可新合成細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6和IL-13等生物介質(zhì)。正是借助于這些生物活性介質(zhì),肥大細(xì)胞在變態(tài)反應(yīng)性疾病過程中發(fā)揮其生物學(xué)作用。因此,肥大細(xì)胞表面受體FcsRI表達(dá)以及其生物學(xué)功能調(diào)控機(jī)制的解析將為變態(tài)反應(yīng)的防治奠定理論基礎(chǔ)。 FcεRI由α-,β-和γ-鏈三部分構(gòu)成,其中α-鏈?zhǔn)荌gE特異性結(jié)合的亞基,p-和γ-鏈參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們的前期試驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子Elf-1在體外可以結(jié)合到FcεRIα-鏈啟動(dòng)子的順式元件周圍的核苷酸序列。Elf-1是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,通過結(jié)合細(xì)胞核內(nèi)的DNA序列,調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)的誘導(dǎo)。Elf-1最初是從人類T細(xì)胞庫(kù)克隆出來(lái)的一細(xì)胞型特異性轉(zhuǎn)錄因子,主要增強(qiáng)HIV-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。然而之后的研究發(fā)現(xiàn),Elf-1在各種造血干細(xì)胞和免疫相關(guān)細(xì)胞中也可以呈現(xiàn)高表達(dá),并且調(diào)控多種基因的表達(dá),如T細(xì)胞中IL-2、GM-CSF、IL-5、IL-2RA和CD4；B細(xì)胞中免疫球蛋白重鏈、blk、lyn和CD1D1；巨核細(xì)胞IL-3和肥大細(xì)胞的干細(xì)胞白血病基因(SCL)。最近報(bào)道顯示在人類嗜堿性粒細(xì)胞系KU812中,Elf-1還可抑制FcεRIγ-鏈的表達(dá)。而在FcεRIα-鏈啟動(dòng)子上具有結(jié)合位點(diǎn)的Elf-1是否能夠影響小鼠肥大細(xì)胞FcεRI的基因表達(dá),目前尚不可知。 除轉(zhuǎn)錄因子外,基因表達(dá)調(diào)控還與染色體上組蛋白乙�；臓顟B(tài)有關(guān)。這種狀態(tài)受控于兩種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,即組蛋白乙�；�(HAT)和組蛋白去乙�；�(HDAC)。曲古菌素A(TSA),是一種強(qiáng)效的HDAC抑制劑(HDACi),屬于羥肟酸類。研究顯示TSA作為一種有效的抗癌制劑,能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),或者誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡。另外,TSA和另一種HDACi, SAHA,還可通過調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)而參與了免疫性疾病,如,系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、移植物抗宿主病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。尤其在變態(tài)反應(yīng)的小鼠模型中,TSA還顯示了其潛在治療效應(yīng)。然而,TSA是否能夠影響變態(tài)反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞——肥大細(xì)胞表面FcεRI的表達(dá)及其功能,目前尚未見相關(guān)報(bào)道。 為此,本研究擬利用EIf-1 siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)和體外TSA刺激等方式,探討轉(zhuǎn)錄因子Elf-1和組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA對(duì)小鼠骨髓來(lái)源的肥大細(xì)胞(BMMC)表面FcεRI基因表達(dá)及其生物學(xué)功能的調(diào)控作用機(jī)制。進(jìn)而,為肥大細(xì)胞相關(guān)的變態(tài)反應(yīng)的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 一、小鼠BMMC的制備 BALB/c小鼠,雌性,6-8周齡。鈍性分離小鼠雙側(cè)股骨,用1ml注射器吸取少量RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗骨髓內(nèi)細(xì)胞至無(wú)菌平皿中。收集液體至10ml離心管中,1000rpm,4℃離心5min,棄上清。用10m1BMMC培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,移至10cm無(wú)菌培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)。常規(guī)換液,培養(yǎng)4周待用。 二、Elf-1 siRNA和Elf-1表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染 按照Mouse Macrophage Nucleofector試劑盒說明操作,選擇Y-001程序,分別將20μM Elf-1 siRNA、Control siRNA和FITC-標(biāo)記的寡核苷酸經(jīng)電轉(zhuǎn)至小鼠1×106BMMC中,37℃分別培養(yǎng)24h(待試劑盒轉(zhuǎn)染效率、Elf-1 mRNA表達(dá)和FcεRIα、p、γ-鏈mRNA表達(dá)檢測(cè))和48h(待Elf-1蛋白表達(dá)檢測(cè))。同法將1μgpGV-B2-aNN0.6或pGL3-Basic分別與25ng pRL-CMV(內(nèi)參)和20μM Elf-1 siRNA/Control siRNA共同電轉(zhuǎn)染至1×106BMMC中；另將5μg pGV-B2-aNN0.6或pGL3-Basic分別與25ng pRL-CMV(內(nèi)參)和10μgpCR3.1-Elf-1或?qū)φ誴CR3.1經(jīng)Bio-Rad Gene PulserⅡ電轉(zhuǎn)染至BMMC中,37℃孵育24h后,收集BMMC(待FcεRI a-鏈啟動(dòng)子熒光素酶活性的分析)。 三、Elf-1表達(dá)鑒定 收集24h Elf-1及Control siRNA核轉(zhuǎn)染的BMMC,按照RNeasy(?) Micro試劑盒的說明,提取細(xì)胞總RNA,利用High Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,利用TaqMan Universal PCR Master Mix和7500Real-time PCR儀進(jìn)行Real-time PCR,分析靶基因Elf-1 mRNA表達(dá)。Elf-1引物為(Mm00468217_ml)。另收集48h Elf-1及Control siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC,裂解細(xì)胞后,經(jīng)7.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)膜1.5h后,用anti-Elf-1 Ab和anti-actinAb作為第一抗體4℃過夜孵育。洗膜后用Alexa Fluor 680 goat anti-rabbit IgG和IRDye 800 goat anti-mouse IgG分別作為抗Elf-1和actin的第二抗體進(jìn)行孵育1h,洗膜后用Odyssey infrared imaging system檢測(cè)Elf-1蛋白的表達(dá)。 四、BMMC FcεRIα-鏈啟動(dòng)子活性檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后的BMMC,按照Dualluciferase assay試劑盒說明,經(jīng)Micro LumatPlus分析FcεRIα-鏈啟動(dòng)子熒光素酶活性。 五、FcεRIa-、β-和γ-鏈mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 收集Elf-1 siRNA/Control siRNA轉(zhuǎn)染后的BMMC。利用RNeasy Micro Kit提取總RNA,利用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA第一鏈,利用TaqMan Universal PCR Master Mix和7500 Real-Time PCR System with TaqMan Gene Expression,進(jìn)行Realtime PCR,分析靶基因α-鏈(Mm00438867_ml)、p-鏈(Mm00442780_m1)和γ-鏈(Mm00438869_g1)mRNA表達(dá)水平。 六、PU.1結(jié)合FcεRIα-鏈啟動(dòng)子能力檢測(cè) 收集Elf-1 siRN A/Control siRNA轉(zhuǎn)染后的BMMC,經(jīng)超聲破碎細(xì)胞,沉淀染色質(zhì)DNA。再分別與Anti-PU.1 goat Ab和goat IgG4℃孵育1h后,經(jīng)7500Realtime PCR System分析PU.1結(jié)合FcεRIα-鏈啟動(dòng)子的能力。所用引物為小鼠FcεRIα-鏈啟動(dòng)子(-82／+1)：正義鏈-82／-56(5'-GGCATAGCTGATGAGTTAACCAGATAC-3'),反義鏈+1／-22(5'-TATGGCTTCGAAAATAGGCTTGA-3')和TaqMan probe-51/-33 (5'-FAM-CAGAAGACATTTCCTTCTC-MGB-3')。 七、TSA體外刺激BMMC 調(diào)制正常小鼠BMMC濃度至1×106／ml,經(jīng)0,2,10,或50 nM TSA 37℃孵育24h(待BMMC FcεRI表達(dá)和功能檢測(cè))或48h(待BMMC凋亡檢測(cè))。 八、BMMC表面FcεRI表達(dá)檢測(cè) 收集Elf-1 siRNA/對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC或TSA體外刺激的BMMC,經(jīng)2.42G阻斷細(xì)胞表面Fc受體后,再與PE-anti FcεRIα-鏈抗體4℃避光孵育1h,PBS洗細(xì)胞2遍,用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面FcεRI表達(dá)。 九、BMMC凋亡檢測(cè) 收集TSA體外刺激48h的BMMC,經(jīng)5μg/ml propidium iodide (PI)和Annexin V-FITC(BD Biosciences)室溫染色15min后,FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析BMMC的凋亡情況。 十、肥大細(xì)胞脫顆粒能力檢測(cè) 收集不同濃度TSA體外刺激的BMMC,經(jīng)1μg／ml IgE 4℃致敏1h,重懸于Tyrode's緩沖液中,1×106／ml,再經(jīng)1μg/ml anti-IgE37℃刺激45min后,收集上清液。加入p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucopyranoside作為底物37℃顯色90min后,經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD405值(ODsample)。IgE致敏細(xì)胞經(jīng)2% Triton處理的培養(yǎng)上清液的OD值作為細(xì)胞顆粒的最大釋放量(ODtotal)。IgE致敏細(xì)胞經(jīng)Typrode's緩沖液孵育的上清液的OD值為ODbase。β-氨基己糖苷酶的釋放量(%)=(ODsample-ODbase) /(ODtotal-ODbase)×100%。 十一、BMMC分泌合成IL-6檢測(cè) TSA體外刺激的BMMC,經(jīng)1μg/ml IgE/anti-IgE體外刺激1h后,提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)Realtime PCR檢測(cè)IL-6mRNA水平；經(jīng)體外刺激3h或6h后,收集培養(yǎng)上清,按照IL-6ELISA kit說明,檢測(cè)上清中IL-6分泌水平。 十二、BMMC IL-6啟動(dòng)子上組蛋白乙�；綑z測(cè) TSA體外刺激的BMMC,經(jīng)1μg/ml IgE/anti-IgE體外刺激30min后,超聲破碎細(xì)胞,沉淀染色質(zhì)DNA。再與Anti-acetyl-histone H3 rabbit IgG、anti-acetyl-histone H4 rabbit antiserum或rabbit IgG4℃孵育1h后,經(jīng)7500Realtime PCR System(Applied Biosystems)分析乙�；M蛋白H3和H4結(jié)合IL-6啟動(dòng)子的能力。所用引物為小鼠IL-6啟動(dòng)子(-84／-9)：正義鏈IL-6-84F(5'-CCCATGAGTCTCAAAATTAGAGAGTTG-3'),反義鏈IL-6-9R (5'-CAGAGCAGAATGAGCTACAGACATC-3')和TaqMan probe IL-6-56P (5'-CTCCTAATAAATATGAGACTGGG-3')。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、siRNA干擾技術(shù)阻斷小鼠BMMC Elf-1的表達(dá) 1、小鼠巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染效果的鑒定 將Nucleofector轉(zhuǎn)染儀的轉(zhuǎn)染程序設(shè)定為Y-001,將FITC-標(biāo)記的對(duì)照寡核苷酸轉(zhuǎn)染至1×106BMMC中,37℃培養(yǎng)24h后,BMMC經(jīng)光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果表明此試劑盒對(duì)BMMC的轉(zhuǎn)染率大約可達(dá)到70%。 2、轉(zhuǎn)染后BMMC的Elf-1的表達(dá) 將Elf-1 siRNA和Control siRNA分別轉(zhuǎn)染至1×106BMMC中,37℃培養(yǎng)24h后,Elf-1 mRNA的表達(dá)經(jīng)Real-time PCR檢測(cè),結(jié)果顯示Elf-1 siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC的Elf-1 mRNA表達(dá)量不足Control siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC的Elf-1mRNA表達(dá)量的1／5。轉(zhuǎn)染48h后,經(jīng)Western blot檢測(cè),Elf-1 siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC的Elf-1蛋白表達(dá)顯著低于Control siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC的Elf-1蛋白表達(dá),由此表明Elf-1 siRNA特異性地抑制BMMC Elf-1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。 二、Elf-1對(duì)小鼠BMMC FcεRI基因表達(dá)調(diào)控的研究 1、Elf-1對(duì)小鼠BMMC FcεRIα-鏈啟動(dòng)子活性的影響 將攜帶受控于FcεRI a-鏈啟動(dòng)子(-605／+29)的熒光素酶的報(bào)告質(zhì)粒pGV-B2-aNN0.6或?qū)φ召|(zhì)粒pGL3-Basic分別與Elf-1 siRNA/Control siRNA轉(zhuǎn)染至BMMC之后,檢測(cè)小鼠BMMC FcεRIα-鏈啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示,Elf-1siRNA/pGL3-Basic共轉(zhuǎn)染和Control siRNA/pGL3-Basic共轉(zhuǎn)染的BMMC FcεRIα-鏈啟動(dòng)子活性均較低,而Elf-1 siRNA/pGV-B2-aNN0.6共轉(zhuǎn)染的BMMC FcεRIα-鏈啟動(dòng)子活性卻顯著高于Control siRNA/pGV-B2-aNN0.6共轉(zhuǎn)染組,這表明Elf-1的表達(dá)下降能夠增強(qiáng)BMMC FcεRI a-鏈啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。相一致的是,Elf-1的過表達(dá)顯著降低BMMC FcεRI a-鏈啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。由此提示,Elf-1對(duì)BMMCFcεRI a-鏈啟動(dòng)子活性具有抑制作用。 2、Elf-1對(duì)小鼠BMMC FcεRIα、β、γ-鏈mRNA表達(dá)的影響 Elf-1 siRNA/Control siRNA轉(zhuǎn)染至BMMC,24h之后,Real-time PCR檢測(cè)小鼠BMMC FcεRIα、β、γ-鏈mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,Elf-1 siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC FcεRI a-鏈mRNA表達(dá)水平顯著高于Control siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC,而FcεRIβ和γ-鏈mRNA的表達(dá)水平兩組未見顯著性差異。由此提示,Elf-1能夠抑制BMMCFcεRIα-鏈的轉(zhuǎn)錄水平。 3、Elf-1對(duì)轉(zhuǎn)錄因子PU.1向小鼠BMMC FcεRI a-鏈啟動(dòng)子募集的影響 Elf-1 siRNA/Control siRNA轉(zhuǎn)染至BMMC,24h之后收集BMMC。經(jīng)CHIPassay結(jié)果顯示, Elf-1 siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC中與PU.1結(jié)合的FcεRI a-鏈啟動(dòng)子的量顯著高于Control siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC,由此提示,Elf-1抑制了另一轉(zhuǎn)錄因子PU.1向BMMC FcεRIα-鏈啟動(dòng)子的募集。 4、Elf-1對(duì)小鼠BMMC表面FcεRI表達(dá)的影響 Elf-1 siRNA/Control siRNA轉(zhuǎn)染至BMMC,48h之后收集BMMC。經(jīng)FACS檢測(cè),結(jié)果顯示,Elf-1 siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC表達(dá)FcεRI的量與Control siRNA轉(zhuǎn)染的BMMC相似。由此提示,Elf-1未影響B(tài)MMC表面FcεRI的表達(dá)。 三、TSA對(duì)小鼠BMMC活化的影響 1、TSA對(duì)小鼠BMMC脫顆粒的影響 小鼠BMMC分別經(jīng)0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,經(jīng)1μg／mlIgE/anti-IgE體外刺激,并檢測(cè)細(xì)胞釋放β-氨基己糖苷酶的量。結(jié)果顯示,未經(jīng)TSA孵育的BMMC的β-氨基己糖苷酶的釋放可達(dá)到50.44+1.63%,TSA孵育后,BMMCβ-氨基己糖苷酶的釋放以劑量依賴方式被抑制。 2、TSA對(duì)小鼠BMMC產(chǎn)生IL-6的影響 小鼠BMMC分別經(jīng)0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,經(jīng)1μg／mlIgE/anti-IgE體外刺激1h,收集BMMC, Real-time PCR檢測(cè)IL-6 mRNA的產(chǎn)生。結(jié)果顯示,TSA以劑量依賴方式抑制小鼠FcεRI介導(dǎo)活化的BMMC IL-6 mRNA的合成。經(jīng)1μg/ml IgE/anti-IgE體外刺激6h,收集BMMC培養(yǎng)上清,經(jīng)ELISA方法檢測(cè)IL-6的分泌情況,結(jié)果同樣顯示TSA以劑量依賴方式抑制小鼠FcsRI介導(dǎo)活化的BMMC IL-6的分泌。 3、TSA對(duì)小鼠BMMC FcεRI表達(dá)的影響 小鼠BMMC分別經(jīng)0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,經(jīng)FACS檢測(cè)細(xì)胞表面FcεRI的表達(dá)。結(jié)果顯示,與未經(jīng)TSA孵育的BMMC相比,50nM TSA孵育后的BMMC FcεRI表達(dá)降低,而2nM和10nM TSA孵育后的BMMC FcεRI表達(dá)沒有明顯變化。 4、TSA對(duì)小鼠BMMC凋亡的影響 小鼠BMMC分別經(jīng)0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育48h后,經(jīng)FACS檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,與未經(jīng)TSA孵育的BMMC相比,50nM TSA孵育后Annexin V-FITC+/PI細(xì)胞即凋亡細(xì)胞明顯增加,而2nM和10nM TSA孵育后凋亡細(xì)胞數(shù)未見明顯變化。 5、TSA對(duì)小鼠BMMC IL-6啟動(dòng)子組蛋白乙�；挠绊� 小鼠BMMC分別經(jīng)0、2、10或50 nM TSA 37℃孵育24h后,經(jīng)1μg／mlIgE/anti-IgE體外刺激0.5h,收集BMMC,沉淀DNA, CHIP assay檢測(cè)結(jié)果顯示,與未經(jīng)TSA孵育的BMMC相比,10nM和50nM TSA均能增強(qiáng)小鼠FcεRI介導(dǎo)活化的BMMC IL-6啟動(dòng)子組蛋白H3和H4乙�；乃�。 結(jié)論 1、小鼠巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒(Amaxa)同樣適用于小鼠BMMC的核酸轉(zhuǎn)染。 2、Elf-1 siRNA可特異性降低小鼠BMMC的Elf-1表達(dá)。 3、Elf-1通過抑制PU.1與α-鏈啟動(dòng)子之間的結(jié)合,抑制小鼠BMMC FcεRI a-鏈啟動(dòng)子的活性和轉(zhuǎn)錄。 4、Elf-1可抑制小鼠BMMC FcεRIa-鏈mRNA的表達(dá),但對(duì)β-和γ-鏈的轉(zhuǎn)錄未見有意義的影響。 5、Elf-1單獨(dú)作用尚不能影響小鼠BMMC FcεRI的表面表達(dá)。 6、TSA以劑量依賴方式抑制FcεRI-介導(dǎo)的BMMC活化。 7、50nM TSA通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡降低小鼠BMMC FcεRI的表達(dá),抑制FcεRI-介導(dǎo)的BMMC脫顆粒和IL-6合成分泌。 8、TSA增強(qiáng)小鼠FcεRI介導(dǎo)活化的BMMC IL-6啟動(dòng)子組蛋白乙�；乃�。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392.12

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1726951