本文選題：鴨乙型肝炎病毒　切入點：鴨原代肝細胞　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型肝炎是嚴重危害人類健康的傳染病。HBV屬于嗜肝DNA病毒科,具有嚴格宿主特異性,不能感染非靈長類實驗動物。目前仍缺乏理想的HBV自然感染細胞培養(yǎng)系統(tǒng),乙型肝炎病毒和宿主細胞之間的相互作用,病毒感染對宿主細胞的蛋白表達及功能的影響,HBV感染的早期階段等分子機制目前仍不是十分清楚。鑒于嗜肝DNA病毒具有相似的病毒結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)以及復(fù)制特點,因此利用鴨乙型肝炎病毒(DHBV)建立的細胞和動物感染模型,用來研究乙型肝炎病毒感染的機制。在體外細胞培養(yǎng)模型中,DHBV能夠自然感染鴨原代肝細胞(Primary Duck Hepatocytes, PDHs)并能進行有效的復(fù)制,感染的細胞可釋放具有感染性的病毒顆粒,因此該感染系統(tǒng)對于研究嗜肝DNA病毒復(fù)制過程具有很高的價值。 蛋白質(zhì)組學(xué)作為當(dāng)今生命科學(xué)熱點與前沿功能基因組學(xué)中的重要研究方法,近年來得到了蓬勃的發(fā)展,已涉足生命科學(xué)中一系列熱點領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動了病毒學(xué)研究的深入,有助于深入了解病毒與宿主相互作用以及引發(fā)疾病的機制等。雞全基因組的測定和蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,為研究DHBV感染對宿主細胞蛋白表達的影響以及尋找與DHBV感染相關(guān)的細胞蛋白帶來了新的契機。本課題采用鴨原代肝細胞—鴨乙型肝炎病毒(PDHs-DHBV)感染模型,運用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析DHBV感染后鴨肝細胞蛋白表達改變情況,并對病毒感染相關(guān)蛋白進行其生物學(xué)方面的探討。 本論文在采用PDHs-DHBV感染模型的基礎(chǔ)上,利用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE),比較分析了DHBV感染后24,72以及120小時的鴨原代肝細胞與未感染的鴨原代肝細胞蛋白差異表達譜,結(jié)果顯示蛋白表達水平差異1.5倍以上蛋白點有51個。對差異蛋白點進行膠內(nèi)酶解、肽段提取后,借助基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)鑒定技術(shù),基于NCBInr數(shù)據(jù)庫,成功鑒定了34個蛋白點,有些膠上的多個蛋白質(zhì)點對應(yīng)于同一個蛋白,在合并重復(fù)蛋白后得到27個非冗余蛋白。采用生物信息學(xué)對差異蛋白的功能進行預(yù)測與分類,結(jié)果顯示差異蛋白主要參與新陳代謝和骨架組成；其余蛋白涉及能量轉(zhuǎn)運、分子伴侶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞增殖等。為了檢驗蛋白質(zhì)組研究結(jié)果,分別挑選了病毒感染后鴨肝細胞中豐度上升和下降的蛋白進行驗證。其中差異蛋白β-actin及Annexin A2 (ANX2)經(jīng)Western blot鹼證,其變化趨勢與雙向電泳結(jié)果一致。另外(?)amin A,熱休克蛋白HSP70以及GAPDH,用人或鼠的多克隆抗體作為一抗,Western blot沒有檢測到相應(yīng)條帶,可能是由于這些抗體不能與鴨相應(yīng)蛋白反應(yīng)所致。 本研究發(fā)現(xiàn)ANX2在病毒感染鴨原代肝細胞后其表達顯著下降。本實驗室前期研究,也發(fā)現(xiàn)在DHBV易感性降低的鴨原代肝細胞中ANX2表達量顯著降低。Annexin A2是膜連蛋白家族的一員,在細胞內(nèi)可能具有比以往所描述的以鈣離子依賴性方式與酸性磷脂結(jié)合更為重要而獨特的功能。ANX2的生物學(xué)功能多種多樣,主要包括：(1)參與形成細胞膜的緊密連接；(2)作為細胞表面受體,是組織纖維蛋白溶解酶的細胞受體；(3)參與胞吞和胞吐、形成離子通道。近年來的研究報道顯示,ANX2在病毒感染中具有重要的作用。文獻報道,在Ca2+存在的條件下,純化的ANX2可以介導(dǎo)巨細胞病毒(CMV)與磷脂膜的結(jié)合,并能夠阻斷CMV對細胞的感染。在HIV感染中,HIV表面的一種成分能與ANX2結(jié)合并促進病毒感染。關(guān)于ANX2在嗜肝DNA病毒感染過程中的作用,目前尚未見報道,ANX2在DHBV感染中可能起著一定的作用,需要通過進一步實驗證明。 為了研究鴨ANX2蛋白在DHBV復(fù)制中作用,首先構(gòu)建了鴨ANX2真核和原核表達質(zhì)粒,采用鴨ANX2真核表達質(zhì)粒DNA初步免疫小鼠、原核表達純化的鴨ANX2蛋白加強免疫的方法,制備了鼠抗鴨ANX2多克隆抗體。利用Western blot驗證了對鴨乙型肝炎病毒感染鴨原代肝細胞差異蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)的差異蛋白ANX2表達的變化,Western blot險測結(jié)果顯示ANX2蛋白變化趨勢與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致。 為了研究ANX2與DHBVpreS/S的相互作用,將pEGFP-DHBVpreS/S與pDsRed-ANX2重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,轉(zhuǎn)染后48小時觀察。在激光共聚焦顯微鏡下觀察鴨ANX2可以與DHBVpreS/S共定位于胞漿細胞膜附近。結(jié)果提示ANX2與DHBVpreS/S可能存在相互作用,與本實驗室前期試驗結(jié)果符合。進而利用DHBVpreS單克隆抗體以及鼠抗鴨ANX2多克隆抗體,進行免疫共沉淀和pull down實驗,證實鴨ANX2與DHBV preS/S蛋白存在相互作用。 為明確鴨ANX2對DHBV復(fù)制的影響,設(shè)計和篩選鴨ANX2 siRNA干擾片段,發(fā)現(xiàn)ANX2 siRNA A2-701可以比較明顯抑制鴨ANX2的mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。進而用ANX2 siRNA A2-701處理鴨原代肝細胞4天后(確證ANX2的表達下調(diào)),再用DHBV感染PDHs,培養(yǎng)4天后,用Dot blot和Southern blot雜交的方法檢測DHBV的復(fù)制水平。結(jié)果顯示,siRNA干擾ANX2后,細胞內(nèi)和細胞培養(yǎng)上清中DHBV DHBV降低。ANX2siRNA干擾初步研究提示ANX2在DHBV的感染過程發(fā)揮一定作用。 本研究的實驗結(jié)果豐富了鴨蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,為研究嗜肝DNA病毒的復(fù)制、肝炎病毒與宿主細胞相互作用研究奠定了一定的基礎(chǔ)。然而,本研究所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白在嗜肝DNA病毒復(fù)制中的作用尚有待于深入研究,隨著鴨基因／或基因組和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的豐富將會推動相關(guān)研究。
[Abstract]:Hepatitis B virus ( HBV ) - induced hepatitis B is an infectious disease which is seriously harmful to human health . HBV belongs to hepatitis B virus family , has strict host specificity and cannot infect non - primate experimental animals . It is still lack of ideal mechanism of HBV natural infection cell culture system , viral infection to host cell protein expression and function . In vitro cell culture model , DHBV can naturally infect duck primary hepatocytes ( PDHs ) and can carry out effective replication , and infected cells can release infectious virus particles , so the infection system has high value for studying the replication process of liver DNA virus .



Proteomics , as an important research method in the genomics of life sciences and frontier functional genomics , has been developed in recent years , and has been involved in a series of hot spots in life sciences . The development of protein group technology has promoted the development of virology research . It is helpful to understand the effect of virus and host interaction and trigger disease . To study the effect of DHBV infection on host cell protein expression and to find a new opportunity to find the cellular protein related to DHBV infection .



On the basis of using PDHs - DHBV infection model , the differential expression profiles of duck primary hepatocytes and uninfected duck primary hepatocytes were analyzed by two - way gel electrophoresis ( 2 - DE ) .
In order to test the results of the proteome research , the protein was verified by Western blot and Western blot analysis showed that these antibodies could not react with duck ' s corresponding protein .



In this study , the expression of ANX2 in duck primary hepatocytes infected with DHBV was significantly decreased . In the early stage of this lab , it was found that the expression of ANX2 was significantly decreased in the duck primary hepatocytes with reduced susceptibility to DHBV .
( 2 ) As the cell surface receptor , it is the cellular receptor of tissue plasminogen ;
In recent years , the purified ANX2 can mediate the binding of cytomegalovirus ( CMV ) to phospholipid membrane and block the infection of CMV to cells . In HIV infection , one component of HIV surface can bind to ANX2 and promote viral infection .



In order to study the role of duck ANX2 protein in DHBV replication , duck ANX2 eukaryotic and prokaryotic expression plasmids were first constructed . Using duck ANX2 eukaryotic expression plasmid DNA preliminary immune mouse , prokaryotic expression purified duck ANX2 polyclonal antibody was prepared . Western blot was used to verify the changes of ANX2 expression in duck ANX2 protein . Western blot analysis showed that the change trend of ANX2 protein was consistent with the results of proteomic analysis .



In order to study the interaction between ANX2 and DHBV preS / S , we observed that ANX2 and DHBV preS / S could be co - transfected into the cell membrane . The results suggested that ANX2 could interact with DHBV preS / S . The results suggested that ANX2 could interact with DHBV preS / S . The results suggested that ANX2 could interact with DHBV preS / S . The results suggested that ANX2 could interact with DHBV preS / S protein .



In order to clarify the effect of ANX2 siRNA on DHBV replication , it was found that ANX2 siRNA A2 - 701 could significantly inhibit the transcription and protein expression of ANX2 mRNA . After 4 days of treatment with ANX2 siRNA A2 - 701 , the replication level of DHBV was detected by Dot blot and Southern blot .



The results of this study have enriched the duck protein database , which lays a foundation for the study of the replication of hepatotropic DNA virus , the interaction between hepatitis virus and host cell . However , the difference protein found in this study has yet to be further studied , and with the development of duck gene / or genome and protein database , the relevant research will be promoted .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R373;R512.62

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本文編號：1724981