本文選題：整合素　切入點(diǎn)：再狹窄　出處：《鄭州大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 自體靜脈移植及血管腔內(nèi)成形術(shù)是目前治療血管閉塞性疾病的有效手段,但是術(shù)后血管早期再狹窄一直是困擾治療效果的一大難題。血管損傷或血管吻合術(shù)后,血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)出現(xiàn)異常的增殖和遷移,這是導(dǎo)致血管早期再狹窄的主要原因。整合素是一類細(xì)胞膜表面糖蛋白受體家族分子,主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖等方面起著重要作用。整合素α5β1是胞外基質(zhì)纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)的主要受體,通過與配體結(jié)合,將細(xì)胞骨架與細(xì)胞連接起來(lái),引起VSMC的移動(dòng),并參與VSMC的遷移、增殖以及血管損傷的修復(fù)過程。但是整合素α5β1與VSMC增殖及遷移的具體關(guān)系尚不明確,本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)誘導(dǎo)整合素α5β1高表達(dá)和基因沉默誘導(dǎo)整合素α5β1低表達(dá),觀察其在VSMC增殖與遷移中的作用。 目的 本課題通過構(gòu)建整合素(Integrin, ITG)α5、β1慢病毒表達(dá)載體及針對(duì)整合素α5、β1的慢病毒siRNA表達(dá)載體,采用雙向調(diào)控的方式,分別誘導(dǎo)VSMC內(nèi)ITGα5、ITGβ1基因高表達(dá)與抑制表達(dá),建立整合素α5、β1誘導(dǎo)高表達(dá)與低表達(dá)VSMC細(xì)胞株。觀察調(diào)控整合素α5、β1表達(dá)對(duì)VSMC增殖及遷移的影響,并檢測(cè)在此過程中整合素信號(hào)傳導(dǎo)通路中黏著斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)及整合素連接激酶(integrin linked kinase, ILK)的變化情況,探討整合素介導(dǎo)的VSMC增殖遷移過程中可能的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。為防治血管成形術(shù)后血管早期再狹窄提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論支持。 方法 1.構(gòu)建載體：分別構(gòu)建整合素α5β1的慢病毒表達(dá)載體及針對(duì)整合素α5、β1的慢病毒siRNA表達(dá)載體。 1)亞克隆重組子：設(shè)計(jì)帶有KpnⅠ和MluⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)的上下游引物,以cDNA克隆pCMV-SPORT6-ITGα5和cDNA克隆pCMV-SPORT6-ITGβ1為模板,PCR擴(kuò)增出ITGα5和ITGβ1 cDNA全長(zhǎng)片段,分別與pGEM-T載體連接后,轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞,篩選得到白色陽(yáng)性菌落,經(jīng)PCR和DNA序列測(cè)定鑒定,獲得陽(yáng)性克隆重組子.pGEM-T-ITGα5、pGEM-T-ITGβ1。經(jīng)KpnⅠ、MluⅠ雙酶切,獲得帶有粘性末端的ITGα5和ITGβ1目的片段,與慢病毒表達(dá)載體pLenti連接,經(jīng)KpnⅠ和MluⅠ雙酶切鑒定得到亞克隆慢病毒重組子pLent-ITGα5、pLent-ITGβ1; 2)克隆重組子：掃描整合素α5、整合素β1 cDNA序列,根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則,分別設(shè)計(jì)出針對(duì)ITGα5和ITGβ1基因的發(fā)卡樣靶序列,并在兩端加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn),復(fù)性和純化發(fā)卡DNA, pRNAT-U6.2/Lenti質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌,經(jīng)PCR擴(kuò)增篩選和DNA測(cè)序,得到克隆重組子pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-1、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-2、pRNAT-U6.2/ Lenti-siITGβ1-1和pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-2; 3)慢病毒包裝：分別提取上述pLent-ITGα5、pLent-ITGβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-1、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-2、pRNAT-U6.2/ Lenti-siITGβ1-1和pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-2及pLentiGFP空載體、pRNAT-U6.2/Leni空載體質(zhì)粒,與病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293 FT,包裝產(chǎn)生慢病毒,以293 FT細(xì)胞內(nèi)GFP蛋白的表達(dá)水平測(cè)定病毒滴度; 2.感染細(xì)胞株：重組慢病毒感染VSMC,建立調(diào)控整合素ITGα5、ITGβ1表達(dá)細(xì)胞株：上述8組慢病毒顆粒分別感染正常VSMC,經(jīng)G418(新霉素)篩選培養(yǎng),建立高表達(dá)ITGα5株(EX-ITGα5),高表達(dá)ITGβ1株(EX-ITGβ1);抑制表達(dá)ITGα5株1 (si-ITGα5-1),抑制表達(dá)ITGα5株2(si-ITGα5-2),抑制表達(dá)ITGβ1株1(si-ITGβ1-1),抑制ITGβ1株2(si-ITGβ1-2),空表達(dá)載體株(Con-Ex),空siRNA載體株(Con-si)。再次用高表達(dá)ITGα5的重組慢病毒感染EX-ITGβ1細(xì)胞,G418篩選培養(yǎng),命名為D-EX；抑制ITGα5的重組慢病毒感染si-ITGβ1-2細(xì)胞,G418篩選培養(yǎng),命名為D-si；熒光定量RT-PCR和Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞ITGα5、ITGβ1基因mRNA及蛋白表達(dá)情況。觀察細(xì)胞株生長(zhǎng)情況； 3.熒光定量RT-PCR檢測(cè)調(diào)控ITGα5、TGβ1表達(dá)對(duì)VSMC細(xì)胞FAK、ILK mRNA的影響； 4.Transwell法測(cè)定調(diào)控ITGα5、TGPβ1表達(dá)對(duì)VSMC細(xì)胞侵襲遷移的影響； 5.MTT法測(cè)定調(diào)控ITGα5、ITGβ1表達(dá)對(duì)VSMC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響； 6.流式細(xì)胞術(shù)分析調(diào)控ITGα5、ITGβ1表達(dá)對(duì)VSMC細(xì)胞周期的影響； 結(jié)果 1.載體的構(gòu)建結(jié)果： 1)通過PCR擴(kuò)增出3150bp(ITGα5)和2397bp(ITGβ1)的基因片段,分別在3150bp+176bp和2397bp+176bp處出現(xiàn)擴(kuò)增帶,經(jīng)同源性比較,插入序列與設(shè)計(jì)完全一致,證實(shí)得到陽(yáng)性克隆重組子PGEM-ITGα5和pGEM-ITGβ1;KpnI和MluI雙酶切及DNA測(cè)序,證實(shí)得到亞克隆慢病毒重組子pLent-ITGα5、pLent-ITGβ1; 2)經(jīng)BLAST同源性分析,ITGα5基因siRNA最終確定的靶序列是735-753(GGACCAGGAAGCTATTTCT)和970-988 (GCTATGTCACCATCCTTAA); ITGβ1基因siRNA最終確定的靶序列是600-618 (GAGCCACAGACATTTACAT)和1283-1301(GTCAGCAGTAGGAACATTA);發(fā)卡樣DNA退火產(chǎn)物,位于100bp下,接近60bp處,與設(shè)計(jì)一致；PCR擴(kuò)增,得到310bp的擴(kuò)增片段的陽(yáng)性克隆,DNA序列測(cè)定,與設(shè)計(jì)一致,證實(shí)得到pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-1、pRNAT-U6.2/ Lenti-siITGα5-2、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-1和pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-2； 3)病毒包裝情況：熒光下顯微鏡觀察測(cè)定,各組重組慢病毒滴度均在7.7×105IU/mL以上； 2.調(diào)控ITGα5、ITGβ1表達(dá)細(xì)胞株的建立 三個(gè)對(duì)照組Con-si(ITGα5 mRNA 0.252±0.026,ITGβ1 mRNA 0.516±0.056)、Con-Ex(ITGα5 mRNA 0.251±0.021,ITGβ1 mRNA 0.505±0.062)及Con(0.238±0.021,0.471±0.051)之間ITGα5、ITGβ1 mRNA表達(dá)量相比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)；與這三個(gè)對(duì)照組比較,高表達(dá)組EX-ITGα5(0.632±0.102,0.534±0.061)、EX-ITGβ1株(0.271±0.031,1.172±0.11)及D-EX(0.587±0.042,1.146±0.108)ITGα5、ITGβ1 mRNA表達(dá)量顯著升高,差異具有顯著性(P0.05)；低表達(dá)組si-ITGα5-1(0.033±0.004,0.459±0.038), si-ITGα5-2(0.075±0.009,0.493±0.054)及si-ITGβ1-1(0.241±0.023, 0.182±0.021),si-ITGβ1-2(0.234±0.025,0.114±0.013)及D-si(0.036±0.005,0.124±0.017)ITGα5、ITGβ1 mRNA表達(dá)量顯著降低,差異具有顯著性(P0.05)； 與此相一致,各組在分子量150kDa處均有ITGα5免疫印跡出現(xiàn),其中EX-ITGα5和D-EX免疫印跡最強(qiáng),顯著強(qiáng)于空白各組,EX-ITGα5,D-EX之間無(wú)明顯差異；抑制組中si-ITGα5-1、si-ITGα5-2及D-si的ITGα5印跡顯著弱于空白各組印跡；si-ITGα5-1與si-ITGα5-2比較,si-ITGα5-1的印跡更弱；各組在分子量138kDa處均有ITGβ1免疫印跡出現(xiàn),其中EX-ITGβ1和D-EX的免疫印跡最強(qiáng),顯著強(qiáng)于空白各組的印跡,EX-ITGβ1和D-EX兩組之間無(wú)明顯差異；抑制組中si-ITGβ1-1、si-ITGβ1-2及D-si的印跡顯著弱于空白各組的印跡；si-ITGβ1-1與si-ITGβ1-2比較,si-ITGβ1-2的印跡更弱；這表明調(diào)控ITGα5及ITGβ1表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。 倒置顯微鏡下觀察,EX-ITGα5、EX-ITGβ1、D-EX組細(xì)胞生長(zhǎng)最快、細(xì)胞形態(tài)最好,成長(zhǎng)條梭狀；下調(diào)群3組細(xì)胞(si-ITGα5、si-ITGβ1、D-si)與對(duì)照群3組細(xì)胞(Con-Ex、Con-si和VSMC)基本一致,生長(zhǎng)速度都略慢于上調(diào)群3組細(xì)胞,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)條梭狀沒有上調(diào)群長(zhǎng),并且圓縮漂浮細(xì)胞多于上調(diào)群。 3.調(diào)控ITGα5、ITGβ1表達(dá)對(duì)VSMC內(nèi)FAK、ILK mRNA表達(dá)情況的影響 三個(gè)對(duì)照組Con-Ex(0.142±0.011)、Con-si(0.129±0.012)、正常VSMC(0.137±0.012)FAK mRNA的表達(dá)量之間相比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)與三個(gè)對(duì)照組相比較,EX-ITGα5(0.165±0.014)、EX-ITGβ1(0.357±0.0194). D-EX(0.419±0.033)、si-ITGα5(0.111±0.009)、si-ITGβ1(0.054±0.008)、D-si(0.034±0.004)差異均有顯著性(P0.05)；其中,EX-ITGβ1和D-EX組的表達(dá)量顯著升高,差異有非常顯著性(P0.01),si-ITGβ1和D-si組表達(dá)量顯著降低,差異有非常顯著性(P0.01)； 三個(gè)對(duì)照組Con-Ex(0.211±0.019)、Con-si(0.194±0.017)及Con(0.203±0.016)ILK mRNA的相對(duì)表達(dá)量之間比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)；與這三個(gè)對(duì)照組相比較,EX-ITGα5(0.216±0.021)、si-ITGα5(0.191±0.018)表達(dá)量無(wú)明顯變化,差異無(wú)顯著性(P0.05)；EX-ITGβ1(0.247±0.024)、D-EX(0.256±0.023)表達(dá)量升高,差異有顯著性(P0.05)；si-ITGβ1(0.159±0.015)、D-si(0.153±0.014)的表達(dá)量降低,差異有顯著性(P0.05)。 這表明,上調(diào)ITGα5基因表達(dá)對(duì)VSMC信號(hào)傳導(dǎo)通路中FAK基因的表達(dá)只有少量的誘導(dǎo)提高作用,而對(duì)ILK則無(wú)提高作用；下調(diào)ITGα5基因表達(dá)對(duì)VAMC內(nèi)FAK及ILK的基因表達(dá)均無(wú)作用；上調(diào)ITGβ1基因表達(dá)對(duì)VSMC內(nèi)FAK、ILK基因表達(dá)都有誘導(dǎo)上調(diào)作用,并且其作用強(qiáng)于上調(diào)ITGα5表達(dá)所誘導(dǎo)的；下調(diào)ITGβ1基因表達(dá)對(duì)VSMC內(nèi)FAK、ILK基因表達(dá)的誘導(dǎo)下調(diào)作用大于下調(diào)ITGα5所誘導(dǎo)的；FAK受到誘導(dǎo)時(shí)的變化明顯強(qiáng)于ILK的變化。 4.調(diào)控ITGα5、ITGβ1表達(dá)對(duì)VSMC細(xì)胞侵襲遷移的影響Transwell實(shí)驗(yàn)中,三個(gè)對(duì)照組Con-Ex(32.9±4.4)、Con-si(36.6±4.1)和Con(35.2±4.7)穿透細(xì)胞數(shù)之間相比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)；與這三個(gè)對(duì)照組相比較,EX-ITGα5(41.5±5.6)和si-ITGα5(29.3±3.9)穿透細(xì)胞數(shù)差異無(wú)顯著性(P0.05)；EX-ITGβ1(62.3±6.8)、D-EX(65.7±7.2)穿透細(xì)胞數(shù)顯著增加,差異有顯著性(P0.05);si-ITGβ1(16.2±2.1)、D-si(14.8±1.7)穿透細(xì)胞數(shù)顯著減少,差異有顯著性(P0.05)。這表明,單獨(dú)上調(diào)ITGβ1和同時(shí)上調(diào)ITGα5、ITGβ1基因表達(dá)可有效促進(jìn)VSMC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力；單獨(dú)下調(diào)ITGβ1及同時(shí)下調(diào)ITGα5、ITGβ1基因表達(dá)可有效抑制VSMC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。單獨(dú)調(diào)控ITGα5表達(dá),對(duì)VSMC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力無(wú)顯著影響。 5.調(diào)控ITGα5、ITGβ1表達(dá)對(duì)VSMC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組(Con-Ex、Con-si、Con之間P0.05)比較,在接種3d、4d、5d時(shí),EX-ITGβ1組和D-EX組MTT測(cè)定的吸光度A值顯著升高(P0.05),EX-ITGα5與si-ITGα5則無(wú)顯著性差異(P0.05)；si-ITGβ1和D-EX顯著降低(P0.05)。這表明,上調(diào)ITGβ1基因表達(dá),對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；下調(diào)ITGβ1基因表達(dá),對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。單獨(dú)調(diào)控ITGα5表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯作用。 6.調(diào)控ITGα5、ITGβ1表達(dá)對(duì)VSMC細(xì)胞周期的影響情況 經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),3個(gè)對(duì)照組之間細(xì)胞G0-G1期、G2-M期、S期構(gòu)成比例,差異無(wú)顯著性(P0.05),總的趨勢(shì)為G0-G1期比例S期,構(gòu)成比例G2-M期。EX-ITGα5、EX-ITGβ1、D-EX中,G0-G1期構(gòu)成比例均顯著下降,差異有顯著性(P0.05),G2-M期構(gòu)成比例均顯著上升,差異有顯著性(P0.05),EX-ITGβ1和D-EX兩組S期構(gòu)成比例顯著上升(P0.05)。這表明,單獨(dú)上調(diào)ITGβ1或同時(shí)上調(diào)ITGα5、ITGβ1基因表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂周期。si-ITGα5、si-ITGβ1、D-si中G0-G1期構(gòu)成比例均顯著上升,差異有顯著性(P0.05),G2～M期構(gòu)成比例均顯著下降,差異有顯著性(P0.05),si-ITGβ1和D-si兩組S期構(gòu)成比例顯著下降(P0.05),這說明在VSMC細(xì)胞中,單獨(dú)下調(diào)ITGβ1或同時(shí)下調(diào)ITGα5、ITGβ1基因表達(dá)可抑制進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂周期。 結(jié)論 1.構(gòu)建出ITGα5、ITGβ1慢病毒表達(dá)載體和慢病毒siRNA表達(dá)載體,成功誘導(dǎo)了VSMC內(nèi)ITGα5及ITGβ1基因高表達(dá)與基因沉默,并建立了ITGα5與ITGβ1高表達(dá)及低表達(dá)的VSMC細(xì)胞株(包括單獨(dú)高、低表達(dá)及同時(shí)高、低表達(dá)ITGα5、ITGβ1細(xì)胞株),這為研究整合素ITGα5及ITGβ1兩個(gè)亞基的不同功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2.在整合素介導(dǎo)的VSMC增殖與遷移過程中,FAK、ILK參與了整合素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。在此信號(hào)的傳導(dǎo)過程中,FAK的變化程度明顯強(qiáng)于ILK, FAK可能是調(diào)控VSMC增殖與遷移的主要信號(hào)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 3.單獨(dú)或者同時(shí)調(diào)控VSMC中ITGβ1基因高表達(dá),可以誘導(dǎo)VSMC重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期,對(duì)VSMC細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用,VSMC細(xì)胞的增殖與遷移能力增強(qiáng)；單獨(dú)或者同時(shí)調(diào)控VSMC中ITGβ1基因低表達(dá),可以抑制VSMC細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用,細(xì)胞的增殖與遷移能力也受到明顯抑制；單獨(dú)調(diào)控ITGα5的基因表達(dá),則對(duì)VSMC的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移能力無(wú)顯著影響。 4.整合素β1確實(shí)與VSMC的生長(zhǎng)、增殖及遷移能力密切相關(guān)。通過RNAi同時(shí)或者單獨(dú)抑制VSMC內(nèi)整合素β1基因表達(dá),可以抑制VSMC的異常增殖及遷移,這為臨床防治血管成形術(shù)后血管早期再狹窄,提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1721229