本文選題：整合素　切入點：再狹窄　出處：《鄭州大學》2010年博士論文

【摘要】： 自體靜脈移植及血管腔內成形術是目前治療血管閉塞性疾病的有效手段,但是術后血管早期再狹窄一直是困擾治療效果的一大難題。血管損傷或血管吻合術后,血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)出現(xiàn)異常的增殖和遷移,這是導致血管早期再狹窄的主要原因。整合素是一類細胞膜表面糖蛋白受體家族分子,主要介導細胞與細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)以及細胞與細胞之間的黏附,在調節(jié)細胞生長、分化、增殖等方面起著重要作用。整合素α5β1是胞外基質纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)的主要受體,通過與配體結合,將細胞骨架與細胞連接起來,引起VSMC的移動,并參與VSMC的遷移、增殖以及血管損傷的修復過程。但是整合素α5β1與VSMC增殖及遷移的具體關系尚不明確,本研究通過轉基因技術誘導整合素α5β1高表達和基因沉默誘導整合素α5β1低表達,觀察其在VSMC增殖與遷移中的作用。 目的 本課題通過構建整合素(Integrin, ITG)α5、β1慢病毒表達載體及針對整合素α5、β1的慢病毒siRNA表達載體,采用雙向調控的方式,分別誘導VSMC內ITGα5、ITGβ1基因高表達與抑制表達,建立整合素α5、β1誘導高表達與低表達VSMC細胞株。觀察調控整合素α5、β1表達對VSMC增殖及遷移的影響,并檢測在此過程中整合素信號傳導通路中黏著斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)及整合素連接激酶(integrin linked kinase, ILK)的變化情況,探討整合素介導的VSMC增殖遷移過程中可能的信號傳導機制。為防治血管成形術后血管早期再狹窄提供實驗依據(jù)與理論支持。 方法 1.構建載體：分別構建整合素α5β1的慢病毒表達載體及針對整合素α5、β1的慢病毒siRNA表達載體。 1)亞克隆重組子：設計帶有KpnⅠ和MluⅠ內切酶位點的上下游引物,以cDNA克隆pCMV-SPORT6-ITGα5和cDNA克隆pCMV-SPORT6-ITGβ1為模板,PCR擴增出ITGα5和ITGβ1 cDNA全長片段,分別與pGEM-T載體連接后,轉化DH5α細胞,篩選得到白色陽性菌落,經(jīng)PCR和DNA序列測定鑒定,獲得陽性克隆重組子.pGEM-T-ITGα5、pGEM-T-ITGβ1。經(jīng)KpnⅠ、MluⅠ雙酶切,獲得帶有粘性末端的ITGα5和ITGβ1目的片段,與慢病毒表達載體pLenti連接,經(jīng)KpnⅠ和MluⅠ雙酶切鑒定得到亞克隆慢病毒重組子pLent-ITGα5、pLent-ITGβ1; 2)克隆重組子：掃描整合素α5、整合素β1 cDNA序列,根據(jù)siRNA靶序列設計原則,分別設計出針對ITGα5和ITGβ1基因的發(fā)卡樣靶序列,并在兩端加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點,復性和純化發(fā)卡DNA, pRNAT-U6.2/Lenti質粒連接,轉化DH5α細菌,經(jīng)PCR擴增篩選和DNA測序,得到克隆重組子pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-1、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-2、pRNAT-U6.2/ Lenti-siITGβ1-1和pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-2; 3)慢病毒包裝：分別提取上述pLent-ITGα5、pLent-ITGβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-1、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-2、pRNAT-U6.2/ Lenti-siITGβ1-1和pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-2及pLentiGFP空載體、pRNAT-U6.2/Leni空載體質粒,與病毒包裝系統(tǒng)共轉染包裝細胞293 FT,包裝產(chǎn)生慢病毒,以293 FT細胞內GFP蛋白的表達水平測定病毒滴度; 2.感染細胞株：重組慢病毒感染VSMC,建立調控整合素ITGα5、ITGβ1表達細胞株：上述8組慢病毒顆粒分別感染正常VSMC,經(jīng)G418(新霉素)篩選培養(yǎng),建立高表達ITGα5株(EX-ITGα5),高表達ITGβ1株(EX-ITGβ1);抑制表達ITGα5株1 (si-ITGα5-1),抑制表達ITGα5株2(si-ITGα5-2),抑制表達ITGβ1株1(si-ITGβ1-1),抑制ITGβ1株2(si-ITGβ1-2),空表達載體株(Con-Ex),空siRNA載體株(Con-si)。再次用高表達ITGα5的重組慢病毒感染EX-ITGβ1細胞,G418篩選培養(yǎng),命名為D-EX；抑制ITGα5的重組慢病毒感染si-ITGβ1-2細胞,G418篩選培養(yǎng),命名為D-si；熒光定量RT-PCR和Western blot法檢測各組細胞ITGα5、ITGβ1基因mRNA及蛋白表達情況。觀察細胞株生長情況； 3.熒光定量RT-PCR檢測調控ITGα5、TGβ1表達對VSMC細胞FAK、ILK mRNA的影響； 4.Transwell法測定調控ITGα5、TGPβ1表達對VSMC細胞侵襲遷移的影響； 5.MTT法測定調控ITGα5、ITGβ1表達對VSMC細胞生長的影響； 6.流式細胞術分析調控ITGα5、ITGβ1表達對VSMC細胞周期的影響； 結果 1.載體的構建結果： 1)通過PCR擴增出3150bp(ITGα5)和2397bp(ITGβ1)的基因片段,分別在3150bp+176bp和2397bp+176bp處出現(xiàn)擴增帶,經(jīng)同源性比較,插入序列與設計完全一致,證實得到陽性克隆重組子PGEM-ITGα5和pGEM-ITGβ1;KpnI和MluI雙酶切及DNA測序,證實得到亞克隆慢病毒重組子pLent-ITGα5、pLent-ITGβ1; 2)經(jīng)BLAST同源性分析,ITGα5基因siRNA最終確定的靶序列是735-753(GGACCAGGAAGCTATTTCT)和970-988 (GCTATGTCACCATCCTTAA); ITGβ1基因siRNA最終確定的靶序列是600-618 (GAGCCACAGACATTTACAT)和1283-1301(GTCAGCAGTAGGAACATTA);發(fā)卡樣DNA退火產(chǎn)物,位于100bp下,接近60bp處,與設計一致；PCR擴增,得到310bp的擴增片段的陽性克隆,DNA序列測定,與設計一致,證實得到pRNAT-U6.2/Lenti-siITGα5-1、pRNAT-U6.2/ Lenti-siITGα5-2、pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-1和pRNAT-U6.2/Lenti-siITGβ1-2； 3)病毒包裝情況：熒光下顯微鏡觀察測定,各組重組慢病毒滴度均在7.7×105IU/mL以上； 2.調控ITGα5、ITGβ1表達細胞株的建立 三個對照組Con-si(ITGα5 mRNA 0.252±0.026,ITGβ1 mRNA 0.516±0.056)、Con-Ex(ITGα5 mRNA 0.251±0.021,ITGβ1 mRNA 0.505±0.062)及Con(0.238±0.021,0.471±0.051)之間ITGα5、ITGβ1 mRNA表達量相比較,差異無顯著性(P0.05)；與這三個對照組比較,高表達組EX-ITGα5(0.632±0.102,0.534±0.061)、EX-ITGβ1株(0.271±0.031,1.172±0.11)及D-EX(0.587±0.042,1.146±0.108)ITGα5、ITGβ1 mRNA表達量顯著升高,差異具有顯著性(P0.05)；低表達組si-ITGα5-1(0.033±0.004,0.459±0.038), si-ITGα5-2(0.075±0.009,0.493±0.054)及si-ITGβ1-1(0.241±0.023, 0.182±0.021),si-ITGβ1-2(0.234±0.025,0.114±0.013)及D-si(0.036±0.005,0.124±0.017)ITGα5、ITGβ1 mRNA表達量顯著降低,差異具有顯著性(P0.05)； 與此相一致,各組在分子量150kDa處均有ITGα5免疫印跡出現(xiàn),其中EX-ITGα5和D-EX免疫印跡最強,顯著強于空白各組,EX-ITGα5,D-EX之間無明顯差異；抑制組中si-ITGα5-1、si-ITGα5-2及D-si的ITGα5印跡顯著弱于空白各組印跡；si-ITGα5-1與si-ITGα5-2比較,si-ITGα5-1的印跡更弱；各組在分子量138kDa處均有ITGβ1免疫印跡出現(xiàn),其中EX-ITGβ1和D-EX的免疫印跡最強,顯著強于空白各組的印跡,EX-ITGβ1和D-EX兩組之間無明顯差異；抑制組中si-ITGβ1-1、si-ITGβ1-2及D-si的印跡顯著弱于空白各組的印跡；si-ITGβ1-1與si-ITGβ1-2比較,si-ITGβ1-2的印跡更弱；這表明調控ITGα5及ITGβ1表達細胞株構建成功。 倒置顯微鏡下觀察,EX-ITGα5、EX-ITGβ1、D-EX組細胞生長最快、細胞形態(tài)最好,成長條梭狀；下調群3組細胞(si-ITGα5、si-ITGβ1、D-si)與對照群3組細胞(Con-Ex、Con-si和VSMC)基本一致,生長速度都略慢于上調群3組細胞,同時細胞形態(tài)條梭狀沒有上調群長,并且圓縮漂浮細胞多于上調群。 3.調控ITGα5、ITGβ1表達對VSMC內FAK、ILK mRNA表達情況的影響 三個對照組Con-Ex(0.142±0.011)、Con-si(0.129±0.012)、正常VSMC(0.137±0.012)FAK mRNA的表達量之間相比較,差異無顯著性(P0.05)與三個對照組相比較,EX-ITGα5(0.165±0.014)、EX-ITGβ1(0.357±0.0194). D-EX(0.419±0.033)、si-ITGα5(0.111±0.009)、si-ITGβ1(0.054±0.008)、D-si(0.034±0.004)差異均有顯著性(P0.05)；其中,EX-ITGβ1和D-EX組的表達量顯著升高,差異有非常顯著性(P0.01),si-ITGβ1和D-si組表達量顯著降低,差異有非常顯著性(P0.01)； 三個對照組Con-Ex(0.211±0.019)、Con-si(0.194±0.017)及Con(0.203±0.016)ILK mRNA的相對表達量之間比較,差異無顯著性(P0.05)；與這三個對照組相比較,EX-ITGα5(0.216±0.021)、si-ITGα5(0.191±0.018)表達量無明顯變化,差異無顯著性(P0.05)；EX-ITGβ1(0.247±0.024)、D-EX(0.256±0.023)表達量升高,差異有顯著性(P0.05)；si-ITGβ1(0.159±0.015)、D-si(0.153±0.014)的表達量降低,差異有顯著性(P0.05)。 這表明,上調ITGα5基因表達對VSMC信號傳導通路中FAK基因的表達只有少量的誘導提高作用,而對ILK則無提高作用；下調ITGα5基因表達對VAMC內FAK及ILK的基因表達均無作用；上調ITGβ1基因表達對VSMC內FAK、ILK基因表達都有誘導上調作用,并且其作用強于上調ITGα5表達所誘導的；下調ITGβ1基因表達對VSMC內FAK、ILK基因表達的誘導下調作用大于下調ITGα5所誘導的；FAK受到誘導時的變化明顯強于ILK的變化。 4.調控ITGα5、ITGβ1表達對VSMC細胞侵襲遷移的影響Transwell實驗中,三個對照組Con-Ex(32.9±4.4)、Con-si(36.6±4.1)和Con(35.2±4.7)穿透細胞數(shù)之間相比較,差異無顯著性(P0.05)；與這三個對照組相比較,EX-ITGα5(41.5±5.6)和si-ITGα5(29.3±3.9)穿透細胞數(shù)差異無顯著性(P0.05)；EX-ITGβ1(62.3±6.8)、D-EX(65.7±7.2)穿透細胞數(shù)顯著增加,差異有顯著性(P0.05);si-ITGβ1(16.2±2.1)、D-si(14.8±1.7)穿透細胞數(shù)顯著減少,差異有顯著性(P0.05)。這表明,單獨上調ITGβ1和同時上調ITGα5、ITGβ1基因表達可有效促進VSMC細胞侵襲和轉移的能力；單獨下調ITGβ1及同時下調ITGα5、ITGβ1基因表達可有效抑制VSMC細胞侵襲和轉移的能力。單獨調控ITGα5表達,對VSMC細胞侵襲和轉移的能力無顯著影響。 5.調控ITGα5、ITGβ1表達對VSMC細胞生長的影響 與對照組(Con-Ex、Con-si、Con之間P0.05)比較,在接種3d、4d、5d時,EX-ITGβ1組和D-EX組MTT測定的吸光度A值顯著升高(P0.05),EX-ITGα5與si-ITGα5則無顯著性差異(P0.05)；si-ITGβ1和D-EX顯著降低(P0.05)。這表明,上調ITGβ1基因表達,對細胞生長有促進作用；下調ITGβ1基因表達,對細胞生長有抑制作用。單獨調控ITGα5表達對細胞生長無明顯作用。 6.調控ITGα5、ITGβ1表達對VSMC細胞周期的影響情況 經(jīng)流式細胞學檢測,3個對照組之間細胞G0-G1期、G2-M期、S期構成比例,差異無顯著性(P0.05),總的趨勢為G0-G1期比例S期,構成比例G2-M期。EX-ITGα5、EX-ITGβ1、D-EX中,G0-G1期構成比例均顯著下降,差異有顯著性(P0.05),G2-M期構成比例均顯著上升,差異有顯著性(P0.05),EX-ITGβ1和D-EX兩組S期構成比例顯著上升(P0.05)。這表明,單獨上調ITGβ1或同時上調ITGα5、ITGβ1基因表達可促進細胞進入分裂周期。si-ITGα5、si-ITGβ1、D-si中G0-G1期構成比例均顯著上升,差異有顯著性(P0.05),G2～M期構成比例均顯著下降,差異有顯著性(P0.05),si-ITGβ1和D-si兩組S期構成比例顯著下降(P0.05),這說明在VSMC細胞中,單獨下調ITGβ1或同時下調ITGα5、ITGβ1基因表達可抑制進細胞進入分裂周期。 結論 1.構建出ITGα5、ITGβ1慢病毒表達載體和慢病毒siRNA表達載體,成功誘導了VSMC內ITGα5及ITGβ1基因高表達與基因沉默,并建立了ITGα5與ITGβ1高表達及低表達的VSMC細胞株(包括單獨高、低表達及同時高、低表達ITGα5、ITGβ1細胞株),這為研究整合素ITGα5及ITGβ1兩個亞基的不同功能奠定了實驗基礎。 2.在整合素介導的VSMC增殖與遷移過程中,FAK、ILK參與了整合素介導的信號傳導。在此信號的傳導過程中,FAK的變化程度明顯強于ILK, FAK可能是調控VSMC增殖與遷移的主要信號結構基礎。 3.單獨或者同時調控VSMC中ITGβ1基因高表達,可以誘導VSMC重新進入細胞分裂周期,對VSMC細胞的生長有明顯促進作用,VSMC細胞的增殖與遷移能力增強；單獨或者同時調控VSMC中ITGβ1基因低表達,可以抑制VSMC細胞重新進入細胞分裂周期,對細胞的生長有明顯抑制作用,細胞的增殖與遷移能力也受到明顯抑制；單獨調控ITGα5的基因表達,則對VSMC的生長、侵襲及轉移能力無顯著影響。 4.整合素β1確實與VSMC的生長、增殖及遷移能力密切相關。通過RNAi同時或者單獨抑制VSMC內整合素β1基因表達,可以抑制VSMC的異常增殖及遷移,這為臨床防治血管成形術后血管早期再狹窄,提供了一個潛在的治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R346

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本文編號：1721229