本文選題：布魯氏菌　切入點(diǎn)：THP-1細(xì)胞　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年碩士論文

【摘要】： 布魯氏菌可引起布魯氏菌病,使大范圍的哺乳動(dòng)物致病,包括人類和家畜,每年約有500 000人受此病困擾,在很大程度上影響民生的需求,同時(shí)也在相當(dāng)程度上影響畜牧業(yè)的發(fā)展,影響國際貿(mào)易及旅游事業(yè),給人們帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌是典型胞內(nèi)致病菌,與其它胞內(nèi)寄生菌不同,布魯氏菌不產(chǎn)生外毒素、無抗吞噬莢膜、無入侵酶、無LPS、無毒性質(zhì)粒、無抗藥性、不發(fā)生抗原變異,其主要的毒力是能侵入巨噬細(xì)胞并在其中增殖[1-5]。巨噬細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞,可消滅多數(shù)入侵的病原體,并激活宿主特異性和非特異性免疫應(yīng)答。布魯氏菌之所以能逃脫巨噬細(xì)胞的殺傷作用并在巨噬細(xì)胞內(nèi)長期存活有以下策略:(1)迅速從吞噬溶酶體逃脫至細(xì)胞質(zhì)中;(2)抑制吞噬溶酶體的形成;(3)抑制巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子;(4)抑制巨噬細(xì)胞的凋亡;(5)抑制巨噬細(xì)胞的抗原提呈能力[3-6]。所有這些策略都需要布魯氏菌與巨噬細(xì)胞相互作用,巨噬細(xì)胞殺菌活性、抗原提呈能力及免疫調(diào)節(jié)能力被布魯氏菌抑制的程度決定了布魯氏菌能否繼續(xù)在宿主細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖,因此,巨噬細(xì)胞早期的免疫應(yīng)答反應(yīng)對布魯氏菌的存活和宿主免疫應(yīng)答的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用。 然而,目前對巨噬細(xì)胞感染過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和布魯氏菌的毒力策略知之甚少,為了揭示巨噬細(xì)胞的免疫監(jiān)視防御機(jī)制和布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的存活機(jī)制,解密布魯氏菌-宿主相互作用的機(jī)制,本室利用二維電泳技術(shù)和質(zhì)譜學(xué)相結(jié)合的方法,對布魯氏菌侵襲宿主細(xì)胞后的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行鑒定,共確定了38個(gè)蛋白表達(dá)差異點(diǎn),分別對應(yīng)38個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。感染性疾病是病原微生物和宿主緊密作用的結(jié)果,研究感染過程中宿主的差異表達(dá)蛋白不僅有助于理解宿主反應(yīng)的分子機(jī)制和病原微生物的致病機(jī)理,還有可能鑒定到新的分子標(biāo)記物以及藥物靶標(biāo),為此本研究結(jié)合國外的研究報(bào)道,選取其中兩個(gè)可能對布魯氏菌侵襲巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用的差異表達(dá)蛋白-CIP29和WDR1進(jìn)行研究以探討其在布魯氏菌感染巨噬細(xì)胞中的可能作用,為布魯氏菌致病機(jī)制與巨噬細(xì)胞免疫防御機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。 目前對CIP29和WDR1的研究很少,生物信息學(xué)預(yù)測CIP29可能有核苷酸結(jié)合能力,參與重要的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)控,參與新陳代謝,也可能是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的蛋白之一,在調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的過程中可能起著非常復(fù)雜的作用。WDR1含9個(gè)WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域,可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的翻轉(zhuǎn),參與細(xì)胞形態(tài)的調(diào)節(jié),參與蛋白-蛋白間的相互作用。布魯氏菌侵襲THP-1細(xì)胞后,CIP29和WDR1的表達(dá)量發(fā)生明顯改變,故本研究將干預(yù)細(xì)胞中CIP29和WDR1的表達(dá),研究其對布魯氏菌侵襲和巨噬細(xì)胞功能的影響,以揭示感染免疫過程中的關(guān)鍵事件,為布魯氏菌的致病機(jī)制和巨噬細(xì)胞的防御機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。 本研究共分兩部分:1、CIP29對布魯氏菌侵襲的影響和其在巨噬細(xì)胞中功能的初步研究。(1)通過RT-PCR方法從細(xì)胞中獲取CIP29基因片段;(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-CIP29,誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組蛋白CIP29,免疫動(dòng)物制備多抗為下一步試驗(yàn)奠定基礎(chǔ);(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-CIP29轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞上調(diào)CIP29在細(xì)胞中表達(dá);(4)檢測CIP29對細(xì)胞凋亡和分泌TNF-α能力的影響;(5)檢測CIP29對布魯氏菌侵襲THP-1細(xì)胞的影響。2、WDR1對布魯氏菌侵襲和巨噬細(xì)胞功能的影響的初步研究。(1)通過RT-PCR方法從細(xì)胞中獲取WDR1基因片段;(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-WDR1,誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組蛋白WDR1,免疫動(dòng)物制備多抗為下一步檢測siRNA干擾效果奠定基礎(chǔ);(3)設(shè)計(jì)合成siRNA序列,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,下調(diào)該蛋白在細(xì)胞中的表達(dá);(4)檢測WDR1對布魯氏菌侵襲THP-1細(xì)胞的影響;(5)檢測WDR1對巨噬細(xì)胞吞噬能力和TNF-α分泌能力的影響。 結(jié)果:通過RT-PCR方法成功獲得了CIP29和WDR1基因,并將其構(gòu)建到表達(dá)載體上,制備了重組蛋白CIP29和WDR1以及各自的多克隆抗體;上調(diào)CIP29在細(xì)胞中的表達(dá)后可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡,與對照組差異顯著;CIP29的高表達(dá)對TNF-α的分泌水平影響不明顯,對布魯氏菌侵襲細(xì)胞的過程略有影響,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過RNAi技術(shù)下調(diào)WDR1的表達(dá)后巨噬細(xì)胞吞噬能力發(fā)生明顯改變,與對照組差異顯著;WDR1的低表達(dá)對巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的水平和布魯氏菌侵襲細(xì)胞的過程無明顯影響。 結(jié)論:巨噬細(xì)胞防御布魯氏菌的侵襲是多個(gè)蛋白共同協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過程,本文用干預(yù)的方法來研究這些差異表達(dá)蛋白的功能只是一種最簡單初步的方法,由于各個(gè)蛋白的功能不同,要想確切了解其在布魯氏菌感染中的作用,需綜合多種技術(shù)手段。在本實(shí)驗(yàn)中,未觀察到CIP29和WDR1在布魯氏菌感染中的非常明確的作用,這是否是由于技術(shù)本身的局限性所造成,還是由于單一蛋白本身在調(diào)節(jié)布魯氏菌感染過程中的復(fù)雜作用使其表現(xiàn)不明顯,其作用還有待用其它的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)結(jié)果初步說明單一蛋白對布魯氏菌侵襲THP-1細(xì)胞的影響可能不顯著,宿主防御布魯氏菌的感染是多種蛋白,多層次協(xié)同作用的結(jié)果。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R516;R392

【引證文獻(xiàn)】

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2 劉倩宏;韓文瑜;;深度測序技術(shù)分析布魯菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7早期轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2012年11期

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本文編號(hào)：1720743