本文選題：呼吸道合胞病毒　切入點：免疫平衡　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文

【摘要】： 完善的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)疫苗,需同時具備激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫的能力。CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在清除病原物方面作用顯著,對RSV的預(yù)防尤為重要。因為,雖然RSV感染后體液免疫是主要的保護(hù)機(jī)制,但這種保護(hù)很不完全,患者在感染后較短時間內(nèi)乃至終生易發(fā)生多次重復(fù)感染。同時,安全的RSV疫苗需要誘導(dǎo)平衡的免疫應(yīng)答反應(yīng)。單獨的重組G蛋白或G蛋白片段僅誘導(dǎo)IgG1型抗體和Th2型細(xì)胞因子優(yōu)勢應(yīng)答,不產(chǎn)生CD8+ T細(xì)胞免疫。 前期我們將含有B細(xì)胞表位的G蛋白片段G1和CD8+ T細(xì)胞表位的片段F1/M2:81-95的融合蛋白G1F1/M2免疫BALB/c小鼠同時誘導(dǎo)了高滴度的特異性抗體和CTL應(yīng)答,而且CD8+ T的誘導(dǎo)下調(diào)了IgG1與IgG2a的比例。但融合蛋白G1F1/M2比含載體蛋白的融合蛋白DsbA-G1F1/M2所誘導(dǎo)的中和抗體弱;而且盡管IgG1/IgG2a的比例有所降低,但仍未達(dá)到自然感染時的水平。因此為進(jìn)一步增強(qiáng)G1F1/M2誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力,尤其是進(jìn)一步增強(qiáng)MHCⅠ分子限制的CD8+ T細(xì)胞的激活,提高CTL活性,進(jìn)一步調(diào)整Th1/Th2的比例,使免疫反應(yīng)更加平衡,我們在G1F/M2融合蛋白中引入可以促進(jìn)抗原交叉提呈的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域HIV TAT或HSP70構(gòu)建新的重組蛋白抗原,并對其抗原性和保護(hù)性等進(jìn)行了研究。 在重組表達(dá)載體pET-G1F/M2的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了兩種新的重組融合蛋白表達(dá)載體,在原核表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)了重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),通過親和層析分離純化制備了用于動物免疫試驗的重組抗原。通過設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方式直接將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域HIV TAT基因連接至G1F/M2基因的上游,構(gòu)建新的重組融合蛋白TAT-G1F/M2。由于在原核表達(dá)系統(tǒng)中不能實現(xiàn)HSP70和G1F/M2的融合表達(dá),因此構(gòu)建了一個可以與HSP70高親和力結(jié)合的融合蛋白Javelin-G1F/M2,在G1F/M2 N端引入的Javelin序列可以與熱休克蛋白HSP70高親和力結(jié)合。通過構(gòu)建引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方式直接將Javelin短肽基因引入至G1F/M2基因的上游。上述表達(dá)載體導(dǎo)入原核表達(dá)系統(tǒng)成功實現(xiàn)了重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),并采用Western-blot鑒定了重組蛋白的RSV抗原特異性。重組蛋白經(jīng)Ni2+螯合親和層析柱分離純化,梯度透析復(fù)性后得到了純度較高的重組蛋白。 在體外先將Javelin-G1F/M2和HSP70孵育制備HSP70: Javelin-G1F/M2復(fù)合物進(jìn)行動物免疫,對復(fù)合物誘導(dǎo)IgG抗體及亞型、中和抗體、CTL應(yīng)答以及保護(hù)性等進(jìn)行了考察,并與Javelin-G1F/M2皮下免疫組和Javelin-G1F/M2鋁佐劑腹腔免疫組進(jìn)行比較研究。在不添加其他佐劑,皮下免疫的條件下HSP70: Javelin- G1F/M2復(fù)合物可誘導(dǎo)高滴度的IgG抗體和強(qiáng)的CTL應(yīng)答,其抗體滴度和CTL應(yīng)答強(qiáng)度均優(yōu)于Javelin- G1F/M2加鋁佐劑腹腔免疫和單獨Javelin-G1F/M2皮下免疫。HSP70: Javelin- G1F/M2復(fù)合物在誘導(dǎo)中和抗體方面與Javelin-G1F/M2加鋁佐劑腹腔免疫基本相當(dāng)。HSP70: Javelin-G1F/M2復(fù)合物可以誘導(dǎo)更為平衡的Th1/Th2應(yīng)答,IgG的亞型IgG1/IgG2a的比值在攻毒前后均低于Javelin-G1F/M2加鋁佐劑腹腔免疫組和單獨Javelin-G1F/M2皮下免疫組;而且攻毒后肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤的程度較Javelin-G1F/M2加鋁佐劑腹腔免疫組輕。病毒滴定結(jié)果表明HSP70: Javelin- G1F/M2復(fù)合物可為小鼠提供完全的保護(hù)作用。 對重組融合蛋白TAT- G1F/M2誘導(dǎo)IgG抗體及亞型、中和抗體、CTL應(yīng)答以及保護(hù)性等進(jìn)行了考察,并與G1F/M2進(jìn)行了比較研究。TAT-G1F/M2誘導(dǎo)的IgG抗體滴度和中和抗體滴度與G1F/M2免疫組基本相當(dāng),但其誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答強(qiáng)度要高于G1F/M2免疫組。而且TAT- G1F/M2誘導(dǎo)的IgG的亞型IgG1/IgG2a的比值在攻毒前后均低于G1F/M2免疫組。保護(hù)性試驗表明TAT-G1F/M2可為小鼠提供完全的保護(hù)作用。 因此可見在G1F/M2融合蛋白的基礎(chǔ)上引入蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域HIV TAT,或者將G1F/M2與熱休克蛋白HSP70構(gòu)建HSP70:G1F/M2復(fù)合物均可通過促進(jìn)RSV抗原的交叉提呈,增強(qiáng)抗原G1F/M2的CTL應(yīng)答,使Th1/Th2應(yīng)答朝平衡的方向偏移,改善Th2優(yōu)勢應(yīng)答導(dǎo)致的毒副作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1707247