本文選題：TNF-α　切入點(diǎn)：中和抗體　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年碩士論文

【摘要】： 腫瘤壞死因子-α是一種具有多種生物學(xué)活性的多效性細(xì)胞因子,來(lái)源極廣泛,主要包括脂肪細(xì)胞、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞。有活性的TNF-α分子量為17KD,以三聚體形式與細(xì)胞表面的TNF受體(TNFR)結(jié)合,介導(dǎo)多種生物學(xué)活性。已知TNF-α是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子,但TNF-α在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡,與其他炎癥因子一起產(chǎn)生多種病理?yè)p傷。在許多疾病,如心血管疾病、惡病質(zhì)和敗血癥休克所致的多器官功能衰竭、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、炎癥性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊亂綜合征(MDS)等的病理生理過(guò)程中TNF-α起著重要的介質(zhì)作用。臨床上,抗TNF-α的治療性抗體被成功用于治療RA、Crohn’s病,同時(shí)研究表明其對(duì)牛皮癬和強(qiáng)直性脊髓炎也具有肯定的療效。目前已有2種抗TNF-α的抗體被FDA批準(zhǔn)用于治療RA——Infliximab(Remicade)和Adalimumab(Humira)。另外,目前臨床在研的多株抗TNF-α的中和抗體也取得良好的效果。人源性抗體在治療中獨(dú)具優(yōu)勢(shì),被認(rèn)為是治療性抗體發(fā)展的最終方向。Humira作為第一個(gè)上市的全人源抗體,2008年年銷售額就超過(guò)30億美元。我國(guó)類風(fēng)濕性患者眾多,在我國(guó)研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的TNF-α人源性中和抗體具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究以原核表達(dá)的hTNF-α為抗原,利用本室構(gòu)建的大容量全合成人源性抗體庫(kù)進(jìn)行篩選,獲得兩株特異性較好并且有一定細(xì)胞學(xué)活性的hTNF-α人源性中和抗體,為相關(guān)疾病的治療研究奠定良好的基礎(chǔ)。 首先,原核系統(tǒng)表達(dá)純化hTNF-α。表達(dá)質(zhì)粒pBVTNF在大腸桿菌DH5α中經(jīng)過(guò)42℃熱誘導(dǎo)6小時(shí)后獲得了hTNF-α可溶性表達(dá),接著根據(jù)其理化性質(zhì)即等電點(diǎn)PI5.6、分子量大小17KD、以及疏水性質(zhì)采用離子交換、疏水層析、凝膠過(guò)濾三種方案對(duì)其進(jìn)行了純化并獲得純品。以獲得的表達(dá)純化的TNF-α作為抗原,對(duì)庫(kù)容量為1.35×1010的大容量人源噬菌體單鏈抗體庫(kù)進(jìn)行了特異性抗體的篩選。三輪篩選后采用ELISA方法進(jìn)行特異性抗體的鑒定,得到3株具有不同序列的單鏈抗體W18、G3-4、T12,并利用pel-SN表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了3株單鏈抗體在大腸桿菌中的分泌表達(dá)。pel-SN表達(dá)載體是本室在大腸桿菌可溶性表達(dá)載體PTIG-Trx的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造后所得到的大腸桿菌分泌型表達(dá)載體,在原載體的基礎(chǔ)上引入了pelB信號(hào)肽序列,并且引入了SfiI和NotI酶切位點(diǎn),以方便從含單鏈抗體基因的噬菌體質(zhì)粒直接克隆到分泌型表達(dá)載體中。對(duì)三株抗體分泌表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行特異性鑒定,W18保持了與噬菌體抗體相同的結(jié)合特異性,但T12喪失了與抗原結(jié)合的活性,G3-4改造為單鏈抗體后的結(jié)合特異性降低。 蛋白質(zhì)通過(guò)特定的三維空間結(jié)構(gòu)發(fā)揮其特殊生物活性。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息對(duì)于了解蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理、酶催化活性、分子穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用以及蛋白質(zhì)分子與配基的相互作用等方面都是至關(guān)重要的。另外蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息也是分子設(shè)計(jì)研究、生命進(jìn)化規(guī)律研究以及藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ),因此蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究非常重要。同源模建方法是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法中應(yīng)用得最多也是最成熟的方法,在蛋白質(zhì)工程研究中已有廣泛應(yīng)用。同源模建方法的理論基礎(chǔ)就是一級(jí)序列決定三維結(jié)構(gòu),序列同源性高的蛋白質(zhì)其三維結(jié)構(gòu)也應(yīng)該相似。T11是本室從大容量抗體庫(kù)中篩選出來(lái)的一株抗TNF-α突變體的特異性噬菌體抗體,該株抗體也能與野生型的TNF-α特異性結(jié)合,但轉(zhuǎn)換為IgG型后其特異性下降。本實(shí)驗(yàn)中將抗天然TNF-α特異性抗體W18與T11抗體分別進(jìn)行計(jì)算機(jī)同源模建,分析TNF-α參與與之相互作用的氨基酸位點(diǎn)以及抗體參與與抗原相互作用的氨基酸。結(jié)果顯示,TNF-α參與與W18相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基為65位、140-157位氨基酸段;而TNF-α參與與T11相互作用時(shí)關(guān)鍵氨基酸殘基29-33位氨基酸殘基、65位氨基酸、140-157位氨基酸位點(diǎn)。另外,分析抗體參與與TNF-α相互作用時(shí),研究結(jié)果初步表明可能W18的輕鏈較T11的輕鏈在參與抗原抗體反應(yīng)中作用的原子更多,而T11的重鏈較W18的重鏈在參與與抗原抗體反應(yīng)中作用的原子更多。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們將W18的輕鏈與T11的重鏈進(jìn)行了重新組合得到一株新的組合抗體即W1hT11,對(duì)其分別在單鏈和全抗水平進(jìn)行了特異性分析,結(jié)果表明該株抗體的特異性較好。 將得到的兩株抗體W18、W1hT11改造為全抗體形式,在FreeStyleTM細(xì)胞中獲得了瞬時(shí)表達(dá)。W18、W1hT11全抗體保持了與TNF-α特異性結(jié)合的活性。采用非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定了W1hT11、W18全抗體與抗原的親和常數(shù)KD分別為4.3×10-8M和7.5×10-8M。 為了分析W18、W1hT11與抗原的結(jié)合表位,根據(jù)計(jì)算機(jī)同源模建的結(jié)果設(shè)計(jì)并構(gòu)建了4個(gè)TNF-α突變體即65位突變?yōu)楦拾彼嵬蛔凅w、84-91位缺失突變體、140-157位缺失突變體以及84-91位與140-157位同時(shí)缺失突變體,實(shí)現(xiàn)了這4個(gè)突變體在大腸桿菌DH5α中的表達(dá)。利用western-blot檢測(cè)了W18、W1hT11單克隆抗體與各突變體的結(jié)合情況。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,W1hT11識(shí)別的抗原表位可能位于140-157位與84-91位,W18識(shí)別的抗原表位可能位于65位與84-91位。 利用TNF-α殺傷L929細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)W18、W1hT11的體外中和活性,結(jié)果表明,W18、W1hT11均能一定程度上拮抗TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的殺傷作用。W1hT11這株抗體在濃度為80ug/ml時(shí)對(duì)TNF-α細(xì)胞毒的中和率達(dá)到90.85%,隨著其濃度的下降中和率降低,到50ug/ml時(shí)對(duì)TNF-α細(xì)胞毒的中和率為43.94%;W18這株抗體的中和率相對(duì)低一些,在濃度為80ug/ml時(shí)中和率為79.58%,隨著其濃度的降低對(duì)TNF-α細(xì)胞毒的中和率也呈相應(yīng)的下降趨勢(shì),到50ug/ml時(shí)對(duì)TNF-α細(xì)胞毒的中和率為36.86%。 本研究從大容量全合成人噬菌體抗體庫(kù)中共獲得了2株具有體外中和活性的抗腫瘤壞死因子-α的人源單克隆抗體W18、W1hT11,為下一步深入研究研制腫瘤壞死因子-α中和抗體藥物奠定了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:TNF - 偽 plays an important role in the treatment of RA , Crohn ' s disease .



The expression plasmid pBVTNF was expressed in E . coli DH5.alpha . for 6 hours after heat induction in E . coli DH5.alpha . The expression vector was purified and purified by ion exchange , hydrophobic chromatography and gel filtration .



The three - dimensional structure information of protein is important for understanding the folding mechanism , catalytic activity , molecular stability , protein domain of protein and the interaction between protein molecule and ligand .



Two antibodies W18 and W1hT11 were transformed into full - antibody form , and transient expression was obtained in FreeStyle.TM . cells . W18 , W1hT11 all - antibody kept the activity of binding with TNF - 偽 . The affinity constants of W1hT11 and W18 were 4.3 脳 10 - 8M and 7.5 脳 10 - 8M , respectively .



In order to analyze the binding epitope of W18 , W1hT11 and antigen , four TNF - 偽 mutants , namely , glycine mutant , 84 - 91 deletion mutant , 140 - 157 deletion mutant and 84 - 91 site and 140 - 157 position deletion mutant were designed and constructed .



The neutralization rate of W18 and W1hT11 was 90 . 85 % . The neutralization rate of TNF - 偽 was 43.94 % when the concentration was 80ug / ml , and the neutralization rate was 79.58 % when the concentration was 80ug / ml , and the neutralization rate of TNF - 偽 cytotoxicity was 36.86 % when the concentration was 80ug / ml .



In this study , two human monoclonal antibodies W18 and W1hT11 with anti - tumor necrosis factor - 偽 in vitro and activity were obtained from a large - capacity fully - synthesized phage antibody library , which laid a good foundation for further study and development of tumor necrosis factor - 偽 and antibody drug .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 劉欽松;李娜;李小剛;董巖巖;張程;孫玉科;;重組人腫瘤壞死因子TNF-α的克隆與原核表達(dá)[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2012年09期

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本文編號(hào)：1694652