本文選題：TMEM98　切入點：克雷伯桿菌肺炎　出處：《大連醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：2008年，國家人類基因組北方研究中心對人類基因組數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析，篩選新的潛在細胞因子編碼基因，并進行功能篩選和系統(tǒng)研究，獲得若干候選基因，TMEM98（transmembrane protein98）是其中之一。迄今對TMEM家族成員功能知之甚少，作用機制更是鮮有報道。 人TMEM98是沒有任何功能性文章報道的新基因，序列已知功能未知，其在多種組織包括免疫系統(tǒng)如脾臟、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓等廣泛表達，推測TMEM-98可能作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子在免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。另外，TMEM98在受到多種炎性因子刺激后表達上調(diào)，表明其可能與炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此，深入研究TMEM98蛋白，為其將來在炎癥治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 目的： 通過急性炎癥小鼠模型的建立及體外炎癥相關(guān)細胞的培養(yǎng)，探索新基因TMEM98在炎癥反應(yīng)中的作用及機制，初步探討將來在炎癥治療中應(yīng)用的可行性。 方法： 1.體內(nèi)實驗 細菌培養(yǎng)：肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae, Kp）LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)取單菌落至液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7~11h，對數(shù)生長期離心收集細菌，生理鹽水重懸，分光光度計（波長620nm）測定OD值，調(diào)整濃度至107cfu/m（lOD=0.7）。 動物分組：雌性6~8周齡C57BL/6小鼠30只，隨機分為正常組（Normal）6只、模型組（Saline+Kp）組12只、實驗組（TMEM98+Kp）12只。實驗組小鼠尾靜脈注射TMEM98蛋白（100ng/只），模型組和正常組小鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水。1h后戊巴比妥鈉（50μg/kg）腹腔麻醉實驗小鼠，頸部無菌手術(shù)，模型組和實驗組氣管內(nèi)注射20μl的Kp懸濁液，正常組給予20μl的生理鹽水。 標本采集和檢測：注射Kp后24h處死實驗動物，分離肺組織，HE染色觀察各組小鼠急性肺炎整體情況；肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性檢測分析各組小鼠肺部中性粒細胞的浸潤及活性；RT-PCR檢測各組小鼠肺部炎性細胞因子（IL-6，IL-8，TNF-α）mRNA的表達；Western Blotting檢測各組小鼠肺部轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達。 2.體外實驗 細胞培養(yǎng)、分組和處理：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical veinendothelial cells, HUVECs）和人單核細胞系THP-1細胞，腫瘤壞死因子（Tumornecrosis factor, TNF）-α和細菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激培養(yǎng)細胞。細胞分為陰性對照組（PBS）、蛋白（TMEM98）處理組、陽性刺激組（TNF-α/LPS）、刺激物+蛋白組（TNF-α/LPS+TMEM98）。 檢測方法：MTT實驗檢測TMEM98蛋白對HUVECs細胞增殖和毒性的影響；Real-time qPCR檢測TMEM98蛋白對HUVECs和THP-1兩細胞系炎性細胞因子（IL-6、IL-8、CXCL-2、MCP-1）的mRNA水平的影響；Western blotting檢測TMEM98蛋白對HUVECs細胞粘附分子（VCAM-1）、細胞內(nèi)信號傳導分子MAPK8、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（P65）的蛋白水平影響。 結(jié)果： 1.體內(nèi)實驗結(jié)果 小鼠肺組織常規(guī)HE染色：模型組肺泡間質(zhì)水腫，大量炎性細胞浸潤，典型急性肺炎表現(xiàn)，實驗組僅見少量炎癥細胞浸潤和少量炎性滲出。提示TMEM98蛋白對急性肺炎有減輕或抑制作用。肺組織勻漿MPO活性檢測：模型組MPO活性顯著高于正常組（P＜0.05），實驗組MPO活性顯著低于模型組（P＜0.05）。MPO的活性間接反映局部中性粒細胞浸潤程度，提示TMEM98蛋白能顯著抑制中性粒細胞的局部浸潤，減輕炎癥損傷。RT-PCR檢測肺組織炎性因子：與正常組相比，細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平在模型組顯著高于正常組（P＜0.05），在實驗組顯著低于模型組（P＜0.05）。提示TMEM98蛋白能夠顯著降低肺組織炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的mRNA水平，抑制急性肺炎。肺組織蛋白的Western Blotting檢測：與正常組相比，模型組NF-κB蛋白水平顯著升高（P＜0.05），實驗組NF-κB蛋白水平相比于模型組（Saline+Kp）顯著降低（P＜0.05）。提示TMEM98蛋白對急性肺炎的抑制作用可能與其降低NF-κB蛋白的水平有關(guān)。 3.體外實驗結(jié)果 MTT法檢測TMEM98蛋白對HUVECs細胞的增殖和毒性：增殖方面，TNF組的OD值高于PBS組（P＜0.05），TNF+TMEM98組OD值顯著低于TNF組（P＜0.05）。細胞毒性方面各組沒有表現(xiàn)出顯著差異。提示TMEM98蛋白對TNF-α誘導的HUVECs細胞增殖有顯著的抑制作用，對HUVECs的細胞毒性和凋亡沒有顯著影響（P＞0.05）。Real-time qPCR檢測HUVECs及THP-1細胞炎性因子mRNA水平：HUVECs細胞：TNF組與PBS組相比，炎性因子IL-6、CXCL-2、MCP-1的mRNA水平顯著升高（P＜0.05），，TNF+TMEM98組IL-6、CXCL-2的mRNA水平顯著低于TNF組（P＜0.05）。MCP-1的mRNA水平在TMEM98組顯著高于PBS組（P＜0.05），在TNF+TMEM98組顯著高于TNF組（P＜0.05）。THP-1細胞：LPS組IL-8、CXCL-2的mRNA水平顯著高于PBS組（P＜0.05），LPS+TMEM98組IL-8、CXCL-2的mRNA水平顯著低于LPS組（P＜0.05）。提示TMEM98能夠顯著抑制HUVECs或THP-1細胞在TNF-α或LPS刺激基礎(chǔ)上炎性細胞因子的分泌（MCP-1除外）。Western blotting方法檢測TMEM98蛋白對HUVECs細胞蛋白的表達情況：TMEM98組與PBS組相比HUVECs細胞NF-κB、MAPK8表達量顯著下降（P＜0.05），TNF+TMEM98組與TNF組相比HUVECs細胞NF-κB、MAPK8表達量也顯著下降（P＜0.05），說明TNF-α能夠上調(diào)HUVECs細胞對VCAM-1、NF-κB、MAPK8蛋白的表達，但這種作用能夠被TMEM98蛋白抑制，推測TMEM98蛋白對于體內(nèi)實驗炎性細胞因子、炎性蛋白表達的抑制作用與其對NF-κB、MAPK8兩條通路的作用密切相關(guān)。 結(jié)論： 1.TMEM98生物信息學預測其為非經(jīng)典途徑的分泌型蛋白。 2.體內(nèi)實驗通過檢測多種細胞因子以及參與局部組織細胞損傷的活性物質(zhì)，確定了TMEM98能夠明顯抑制Kp造成的急性肺炎，其中對NF-κB通路的抑制作用是形成整體抑制作用的重要因素之一。 3.體外實驗通過檢測TMEM98對HUVECs、THP-1兩種細胞的增殖和毒性的影響以及多種細胞因子、黏附分子VCAM-1、通路蛋白NF-κB、 MAPK8的表達情況，確定TMEM98蛋白能夠顯著抑制TNF-α誘導的HUVECs細胞增殖及多種細胞因子的分泌，顯著抑制LPS誘導的THP-1細胞多種細胞因子的分泌。這種抑制作用與通路蛋白NF-κB、 MAPK8的下調(diào)有關(guān)。
[Abstract]:In 2008, China National Center for human genome research on the human genome database by bioinformatics analysis, screening of potential new genes encoding cytokines, and study the function and screening system, obtained some candidate genes, TMEM98 (transmembrane protein98) is one of the few members of the TMEM family. So far on the function of knowledge, the mechanism is rarely reported.
TMEM98 is a new gene without any functional reports, sequence of unknown function, including the immune system such as spleen, thymus, lymph node in a variety of organizations, such as the bone marrow is widely expressed, we suggest that TMEM-98 may be an important immune regulatory factor play an important role in the immune system. In addition, the upregulation of TMEM98 expression under a variety of inflammatory after cytokine stimulation, suggesting that it may be with the occurrence of inflammation is closely related to the development, therefore, in-depth study of the TMEM98 protein, which lays a foundation for its future application in the treatment of inflammation.
Objective:
Through the establishment of acute inflammation mouse model and the cultivation of inflammatory related cells in vitro, we explored the role and mechanism of new gene TMEM98 in inflammatory response, and preliminarily discussed the feasibility of future application in inflammatory therapy.
Method錛

本文編號：1691121