發(fā)布時(shí)間：2018-03-29 17:40

  本文選題：慢性阻塞性肺疾病　切入點(diǎn)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激　出處：《中南大學(xué)》2010年博士論文

【摘要】： 研究背景肺泡上皮細(xì)胞凋亡是COPD發(fā)病的重要機(jī)制之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是一條新的細(xì)胞凋亡途徑。有關(guān)ERS標(biāo)志性分子GRP78的生物學(xué)功能的研究已經(jīng)引起生物學(xué)家們的廣泛重視,GRP78在ERS時(shí)表達(dá)增加,被認(rèn)為可以減輕ERS,從而減少細(xì)胞凋亡。GRP78表達(dá)上調(diào)的信號(hào)傳導(dǎo)通路目前不完全清楚,有研究提示p38MAPK途徑可以上調(diào)GRP78的表達(dá)。吸煙是COPD最重要的發(fā)病因素。香煙煙霧中富含氧自由基和多種毒性成分,氧化應(yīng)激和毒性物質(zhì)都是ERS的誘發(fā)因素,因此吸煙很可能觸發(fā)ERS。國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí),在COPD中,香煙煙霧可以引起p38MAPK的活化。結(jié)合上述研究,我們推測(cè)在COPD發(fā)生過程中,吸煙可能通過誘導(dǎo)ERS導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡從而參與COPD肺氣腫的形成,在此過程中GRP78表達(dá)上調(diào),發(fā)揮抗凋亡作用,p38MAPK途徑在香煙煙霧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)過程中起重要的調(diào)控作用。本研究擬以COPD大鼠及香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)的A549細(xì)胞為主要模型,探討香煙煙霧誘導(dǎo)ERS的發(fā)生、GRP78的抗凋亡作用以及p38MAPK途徑在GRP78表達(dá)過程中的調(diào)控作用。 第一章COPD大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡 目的觀察COPD大鼠肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生及肺泡上皮細(xì)胞的凋亡情況。 方法24只Wistar大鼠隨機(jī)均分為2組：正常對(duì)照組和COPD模型組。采用被動(dòng)吸煙加氣管內(nèi)注射脂多糖法建立COPD大鼠模型。造模完成后,測(cè)定各組大鼠的肺功能、觀察肺組織病理學(xué)變化、免疫組化檢測(cè)GRP78在肺組織中的表達(dá)和分布,RT-PCR檢測(cè)GRP78、CHOP mRNA水平,Western blot檢測(cè)GRP78、CHOP、active caspase-12蛋白水平。TUNEL法檢測(cè)肺泡上皮細(xì)胞凋亡 結(jié)果COPD模型組大鼠FEV0.3/FVC (%)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)均較對(duì)照組明顯降低,而氣道阻力(RI)明顯增高；免疫組化結(jié)果顯示GRP78表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞的細(xì)胞漿中,以肺泡上皮細(xì)胞明顯。對(duì)照組GRP78呈弱陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒；模型組GRP78呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性產(chǎn)物為棕褐色顆粒。與對(duì)照組相比,模型組肺組織GRP78表達(dá)顯著增高；RT-PCR結(jié)果顯示COPD模型組大鼠支氣管肺組織中GRP78 mRNA和CHOP mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高；Western blot結(jié)果顯示COPD模型組大鼠肺組織中GRP78、CHOP、active caspase-12蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高；TUNEL法結(jié)果顯示COPD模型組肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常對(duì)照組顯著增高。 結(jié)論采用被動(dòng)吸煙加氣管內(nèi)注射脂多糖的方法,成功復(fù)制出了COPD大鼠模型;COPD大鼠肺組織發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,尤以肺泡上皮細(xì)胞明顯；COPD大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要途徑。 第二章香煙煙霧提取物誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78的表達(dá)及其抗凋亡作用 目的觀察CSE對(duì)A549細(xì)胞GRP78表達(dá)的影響,并探討GRP78抗細(xì)胞凋亡作用。 方法第一部分,體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,給予不同濃度(0%-10%)和不同時(shí)間(0h-24h)的CSE干預(yù)后,以RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)GRP78 mRNA和蛋白表達(dá)；第二部分,將A549細(xì)胞分為四個(gè)處理組：對(duì)照組,5%CSE組,GRP78siRNA+5%CSE組,control siRNA+5%CSE組。以RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)active caspase-3蛋白表達(dá)水平,TUNEL檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化。 結(jié)果隨著CSE濃度的增加或干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),A549細(xì)胞GRP78 mRNA及GRP78蛋白表達(dá)量逐漸增加,以5%CSE、干預(yù)12h組增加最明顯,但繼續(xù)增加CSE濃度或延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間,GRP78表達(dá)并不增加,反而下降；小干擾GRP78后,RT-PCR、Western blot檢測(cè)小干擾組GRP78表達(dá)顯著下降,GRP78siRNA成功下調(diào)了GRP78基因表達(dá)；GRP78水平下調(diào)后,A549細(xì)胞active caspase-3的蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡指數(shù)與單純的CSE刺激組比較顯著升高。 結(jié)論低濃度、短時(shí)間CSE刺激后,A549細(xì)胞啟動(dòng)了保護(hù)性的非折疊蛋白反應(yīng),GRP78表達(dá)上調(diào)。但高濃度、長(zhǎng)時(shí)間CSE刺激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)功能障礙,其保護(hù)機(jī)制失代償,GRP78表達(dá)反而下降；GRP78抵抗香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡。 第三章p38MAPK在香煙煙霧提取物誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)過程中的調(diào)控 目的明確p38MAPK在CSE誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GRP78表達(dá)過程中的調(diào)控作用。 方法第一部分,24只Wistar大鼠隨機(jī)均分為2組：正常對(duì)照組和COPD模型組。采用被動(dòng)吸煙加氣管內(nèi)注射脂多糖法建立大鼠COPD模型。造模完成后,Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織內(nèi)P-p38、GRP78蛋白表達(dá)水平,并將二者進(jìn)行相關(guān)性分析；第二部分,將A549細(xì)胞分為三個(gè)處理組：對(duì)照組,5%CSE組,SB203580+5%CSE組,以RT-PCR、Western blot分別檢測(cè)GRP78 mRNA和蛋白的表達(dá)水平變化。 結(jié)果COPD模型組大鼠支氣管肺組織中P-p38蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高,且P-p38蛋白水平與GRP78蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.848, P0.01); p38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)后,P-p38蛋白表達(dá)水平顯著降低。抑制了p38MAPK通路活化后再給予CSE干預(yù),GRP78 mRNA及GRP78蛋白表達(dá)水平較單純的CSE刺激組顯著降低。 結(jié)論COPD中p38MAPK途徑發(fā)生了磷酸化激活；p38MAPK途徑能上調(diào)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的GRP78表達(dá)水平。
[Abstract]:The study suggests that smoking is the most important factor in COPD . The study suggests that smoking may induce apoptosis of alveolar epithelial cells by inducing ERS . The study suggests that smoking may play an important role in the pathogenesis of COPD . The study suggests that smoking may induce the apoptosis of alveolar epithelial cells by inducing ERS .


Chapter 1 Stress and Apoptosis in the Lung Tissue of COPD Rats


Objective To investigate the occurrence of endoplasmic reticulum stress and the apoptosis of alveolar epithelial cells in COPD rats .


Methods 24 Wistar rats were randomly divided into 2 groups : normal control group and COPD model group .


Results In COPD model group , FEV0.3 / FVC ( % ) and dynamic lung compliance were significantly lower than those in the control group , while the resistance to airway resistance ( RI ) was significantly increased .
The results showed that GRP78 was expressed in alveolar epithelial cells , bronchial epithelial cells , vascular endothelial cells and other cells . The results showed that GRP78 was weakly positive in alveolar epithelial cells .
Compared with the control group , the expression of GRP78 in the lung tissue of the model group was significantly higher than that of the control group .
RT - PCR showed that the expression of GRP78 mRNA and CHOP mRNA in broncho - lung tissues of COPD model group was significantly higher than that in the control group .
Western blot showed that the expression of GRP78 , CHOP and active caspase - 12 in lung tissues of COPD model group was significantly higher than that in the control group .
TUNEL method showed that the apoptosis index of alveolar epithelial cells in COPD model group was significantly higher than that in control group .


Conclusion The model of COPD rats was successfully reproduced by the method of passive smoking and intratracheal injection of lipopolysaccharide . The lung tissue of COPD rats had an endoplasmic reticulum stress , especially in the alveolar epithelial cells .
In COPD rats , the apoptosis of alveolar epithelial cells is increased , and the endoplasmic reticulum stress may be an important way to mediate the apoptosis of alveolar epithelial cells .


Study on the expression of GRP78 in alveolar epithelial cells induced by cigarette smoke extract and its anti - apoptotic effect


Objective To investigate the effect on the expression of GRP78 in A549 cells and to explore the anti - apoptotic effect of GRP78 .


Methods The expression of GRP78 mRNA and protein was detected by RT - PCR and Western blot in the first part of the cell culture A549 cells , different concentrations ( 0 % -10 % ) and different time ( 0h - 24h ) .
The expression level of GRP78 mRNA and protein was detected by Western blot , and the expression level of active caspase - 3 protein was detected by Western blot , and the apoptosis index ( AI ) of A549 cells was detected by TUNEL .


Results The expression of GRP78 mRNA and GRP78 protein in A549 cells increased gradually with the increase of the concentration or the time of intervention . The expression of GRP78 mRNA and GRP78 protein in A549 cells increased most obviously , but the expression of GRP78 was not increased , but the expression of GRP78 decreased .
The expression of GRP78 was significantly decreased by RT - PCR and Western blot after GRP78 , and GRP78 siRNA was successfully downregulated by GRP78 siRNA .
After downregulation of GRP78 , the expression level of active caspase - 3 and the apoptosis index of A549 cells were significantly increased compared with that of the simple ones .


Conclusion The expression of GRP78 is up - regulated in A549 cells after stimulation of low - concentration and short - term , but the expression of GRP78 is decreased .
GRP78 is resistant to the apoptosis of A549 cells induced by cigarette smoke extract .


The regulation of p38MAPK in the expression of GRP78 in alveolar epithelial cells induced by cigarette smoke extract


Objective To clarify the role of p38MAPK in the expression of GRP78 in alveolar epithelial cells .


Methods In the first part , 24 Wistar rats were randomly divided into 2 groups : normal control group and COPD model group .
In the second part , A549 cells were divided into three treatment groups : control group , 5 % sse group , SB203580 + 5 % se group , RT - PCR and Western blot were used to respectively detect the expression level of GRP78 mRNA and protein .


Results The expression level of P - p38 protein in the lung tissues of rats with COPD was significantly higher than that in the control group ( r = 0.848 , P0.01 ) . The level of P - p38 protein was significantly decreased after the intervention of p38MAPK inhibitor SB203580 .


Conclusion The p38MAPK pathway in COPD is activated by phosphorylation .
The p38MAPK pathway can regulate the expression level of GRP78 induced by cigarette smoke extract .

【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1682152