本文選題：間充質干細胞　切入點：破骨細胞　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2010年博士論文

【摘要】： 研究背景和目的 破骨細胞是一類起源于造血干細胞的成體細胞,它們大部分貼附于骨表面,可以分泌多種酸和溶解酶來降解骨組織。在機體代謝穩(wěn)定時,只有少量的破骨細胞生成,與成骨細胞相協(xié)調,參加骨重塑。近來,研究人員發(fā)現(xiàn)破骨細胞還參與機體防御與修復,炎性疾病以及腫瘤的骨轉移。破骨細胞的發(fā)育很大程度上受到其所在的細胞微環(huán)境的影響,其周圍的細胞分泌多種重要細胞因子,表達細胞表面分子來調節(jié)破骨細胞的生成。 間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最早在骨髓中被發(fā)現(xiàn),適宜的條件下能分化為多種細胞。MSCs及其分化的細胞是骨髓微環(huán)境中的主要支持細胞。MSCs借助細胞因子和/或細胞間直接接觸,調節(jié)大多數(shù)造血細胞的存活、增殖和分化。 雖然MSCs和破骨細胞都位于骨髓微環(huán)境中,然而,有關MSCs和破骨細胞之間聯(lián)系的研究卻不多。本研究借助于一種可靠高效的小鼠MSCs分離培養(yǎng)方法,著重研究了MSCs受到腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)刺激后,對破骨細胞的抑制作用及其機制。并借助類風濕關節(jié)炎病人的關節(jié)腔液( rheumatoid arthritis synovial fluid, RASF)和脂多糖注射小鼠模型,探究了MSCs在體外和體內復雜炎性微環(huán)境中對破骨細胞的調節(jié)作用。同時,初步研究了RASF來源的MSCs對破骨細胞的調節(jié)作用。 研究方法 1、采用骨實質分離培養(yǎng)法獲得小鼠MSCs,對其進行三系誘導分化鑒定。以流式分析其免疫表型。 2、分離小鼠CD11b+單核細胞,將其與MSCs共培養(yǎng),部分培養(yǎng)組內再添加巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)和核因子κB的受體激活子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL),觀察MSCs對于單核細胞來源的破骨細胞分化、成熟、存活和骨吸收能力的影響。 3、以TNF-α預處理MSCs,然后再用于和單核細胞共同培養(yǎng)。有些實驗組中,直接添加TNF-α到MSCs和單核細胞的共培養(yǎng)體系中去。上述實驗組同樣應用于象牙片共培養(yǎng)試驗,檢測破骨細胞的骨吸收能力。接下來,采用transwell培養(yǎng)法把MSCs和單核細胞共同培養(yǎng)但是避免直接接觸,再進一步采用RT-PCR,real-time PCR和ELISA來分析MSCs中破骨細胞生成抑制因子-骨保護素(osteoprotegerin, OPG)的表達情況以及MSCs受到TNF-α刺激后,OPG在mRNA和分泌蛋白水平的變化。分析TNF-α刺激后,MSCs中破骨細胞生成促進因子RANKL, M-CSF和白細胞介素6 (Interleukin, IL-6)的mRNA表達情況。 4、在此基礎上,采用western-blot檢測MSCs受到TNF-α刺激后,其中P38/MAPK, ERK/MAPK和JNK/SAPK通路有無發(fā)生活化。采用這三條通路相應的通路抑制劑來預處理MSCs,再給予TNF-α刺激,然后以real-time PCR檢測MSCs中OPG的mRNA水平。同時,采用通路抑制劑來預處理MSCs,再給予TNF-α刺激,然后以單核細胞共同培養(yǎng),觀察MAPK通路活化對于破骨細胞生成的影響。 5、分別對TNF-α刺激后的MSCs免疫學表型和多向分化能力做檢測。同時,采用CFSE標記法,觀察TNF-α刺激過的MSCs能否抑制Con A引起的CD3+T淋巴細胞增殖。 6、采集20例RASF樣本,以ELISA法測定各樣本中的TNF-α濃度。以RASF樣本刺激MSCs,再把MSCs和單核細胞共同培養(yǎng),觀察破骨細胞生成的情況。 7、經尾靜脈給脂多糖小鼠注射MSCs,取小鼠股骨做病理切片,做原位抗酒石酸的酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色,觀察破骨細胞生成情況。 8、從RASF中分離得到RASF-MSCs,將其與人CD14+單核細胞共同培養(yǎng),以TRAP染色判斷其對破骨細胞生成的影響。 研究結果 1、以骨實質法從單只小鼠取材培養(yǎng),可以在14天時獲得107以上數(shù)量的MSCs。收獲的細胞具備成骨、成脂肪和成軟骨三系分化能力,具有經典的MSCs免疫表型。 2、MSCs能夠單獨或者與M-CSF和RANKL協(xié)同促進單核細胞分化為破骨細胞,這種促進作用與MSCs的數(shù)量和共培養(yǎng)時間成正相關。MSCs還能夠將培養(yǎng)體系中的TRAP+且多個細胞核的成熟破骨細胞占全部TRAP+細胞中的比例由19%提高到39%。添加了MSCs之后,長期存活的破骨細胞數(shù)量比沒有添加MSCs的實驗組多了接近兩倍。 3、TNF-α刺激之后,MSCs轉為抑制單核細胞向破骨細胞分化,這種抑制作用與TNF-α的濃度和刺激時間成正相關。TNF-α刺激之后的MSCs,在MSCs和單核細胞數(shù)量比例較低的時候就開始抑制破骨細胞生成,在二者比例1:5的時候即發(fā)揮抑制作用。這種抑制破骨細胞生成的作用較為持久,可達到12天以上。培養(yǎng)體系中直接添加TNF-α會產生更強烈的抑制效果。 4、MSCs和TNF-α刺激之后的MSCs對破骨細胞的骨吸收能力發(fā)揮不同的調節(jié)作用。無TNF-α時,MSCs促進破骨細胞在成象牙片上形成較大的骨吸收陷窩;以TNF-α預處理MSCs或者直接把TNF-α添加到共培養(yǎng)體系中,象牙片上的骨吸收陷窩很小或者沒有骨吸收陷窩形成。 5、Transwell實驗表明MSCs分泌的可溶性分子在調節(jié)破骨細胞分化和功能方面起著重要作用。RT-PCR結果表明MSCs表達多種破骨細胞的調節(jié)因子包括RANKL, M-CSF, IL-6和OPG。Real-time PCR結果顯示TNF-α能上調MSCs中OPG的mRNA表達,這種上調作用與TNF-α的濃度和作用時間成正相關。與之相對應,ELISA結果顯示TNF-α促進MSCs分泌OPG,這種促進作用與TNF-α的濃度成正相關。Real-time PCR結果顯示TNF-α略微下調了MSCs中RANKL, IL-6和M-CSF的mRNA水平。 6、Western blot結果顯示TNF-α引發(fā)了MSCs中p38/MAPK, ERK/MAPK和JNK/SAPK通路的活化。Real-time PCR結果顯示p38/MAPK通路的抑制劑SB23580HCL和JNK/SAPK通路的抑制劑JNK inhibitor II,能部分取消TNF-α引起的MSCs中OPG的mRNA上調,而ERK/MAPK通路的抑制劑PD98059則沒有類似作用。破骨細胞培養(yǎng)結果與之相似, SB23580HCL和JNK inhibitor II,能部分取消TNF-α活化的MSCs抑制破骨細胞的作用,而PD98059則沒有類似作用。 7、TNF-α活化的MSCs保持了其細胞形態(tài),免疫表型和多向分化能力,可以抑制Con A引起的CD3+T淋巴細胞增殖。 8、RASF處理后,MSCs對破骨細胞生成的調節(jié)作用發(fā)生了變化。當樣本中TNF-α濃度較低的時候,MSCs促進破骨細胞的生成;當樣本中TNF-α濃度較高的時候,MSCs抑制破骨細胞的生成。 9、小鼠股骨切片的TRAP染色結果顯示:給予脂多糖小鼠輸注MSCs后,能減少其體內破骨細胞的生成。 10、RASF-MSCs具有經典的MSC免疫表型,但是與人骨髓MSCs相比,其多向分化能力有所下降。當其與單核細胞共培養(yǎng)時,促進破骨細胞生成的能力較人骨髓MSCs強。 結論 1、MSCs可以促進單核細胞來源的破骨細胞分化、成熟、存活,增強其骨吸收能力。MSCs表達的細胞表面分子和分泌的多種促進破骨細胞發(fā)育的細胞因子是這種促進作用的基礎。 2、率先報道了在炎性因子TNF-α作用下,MSCs轉為抑制破骨細胞的發(fā)育和功能。這種轉變的部分原因是:MSCs與TNF-α接觸后,細胞內p38/MAPK和JNK/SAPK通路活化,抑制破骨細胞的因子OPG分泌增加,從而抑制破骨細胞的發(fā)育和功能。以類風濕關節(jié)炎病人的關節(jié)腔液刺激MSCs也具有相似的抑制作用。給予脂多糖小鼠注射MSCs可以在體內抑制破骨細胞生成。 3、與骨髓MSCs相比,RASF-MSCs促進破骨細胞生成的作用更強,提示不同組織來源的MSCs對破骨細胞的調節(jié)作用不同。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 孫艷培;同種異體BMSC對EAT的療效及CD4~+CD25~+Treg細胞影響的研究[D];天津醫(yī)科大學;2012年

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本文編號：1675136