本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：腺病毒載體　出處：《暨南大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 目的: 探索轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)胎兒骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞(FBMSCs)分化發(fā)育為β功能樣細(xì)胞。 方法: (1)分別提取胎兒胰腺組織(自然流產(chǎn)的、經(jīng)患者同意的、3-6個(gè)月大小)的總RNA,通過(guò)RT—PCR體外擴(kuò)增人Pdx1、Pax4、NeuroD1、Nkx6.1等轉(zhuǎn)錄因子基因,分別克隆到pEGFP-N1或pIRES載體上,構(gòu)成重組質(zhì)粒;行L02細(xì)胞株轉(zhuǎn)染,以觀測(cè)目的基因表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位及功能基因的篩選。 (2)應(yīng)用酶切與酶連的方法構(gòu)建功能上具有協(xié)同效應(yīng)的PDX1與NKX6.1雙基因表達(dá)的,并對(duì)MSCs高效感染率的腺病毒載體。 (3)采用高壓生理鹽水灌沖并聯(lián)合密度梯度離心法獲取人胎兒骨髓組織中單個(gè)核細(xì)胞,應(yīng)用貼壁篩選法分離、純化和擴(kuò)增胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(FBMSCs),觀察細(xì)胞形態(tài),繪制生長(zhǎng)曲線,測(cè)定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞倍增時(shí)間;檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志;并分別予以成骨和成脂誘導(dǎo)等功能性鑒定。 (4)雙基因腺病毒(Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1)感染誘導(dǎo)FBMSCs分化,并通過(guò)細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化,初步鑒定目的細(xì)胞的分化發(fā)育階段;分別應(yīng)用多種細(xì)胞因子進(jìn)行分步刺激,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步分化與發(fā)育為β功能樣細(xì)胞。 (5)采用鏈脲佐菌素(STZ)成功制作糖尿病模型鼠后;將誘導(dǎo)的β樣細(xì)胞植入糖尿病模型鼠腎被膜下,觀測(cè)對(duì)糖尿病模型鼠的血糖調(diào)節(jié)能力。 結(jié)果: (1)RT-PCR擴(kuò)增獲得Pdx1、Nkx6.1、NeuroD1與Pax4等轉(zhuǎn)錄因子基因并構(gòu)建質(zhì)粒載體pEGFP-N1/Nkx6.1、pEGFP-N1/Pax4、PIRES-Pdx1/NeuroD1等,酶切與測(cè)序鑒定表明載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞后,RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)與間接熒光等檢測(cè)均證實(shí)目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),且相關(guān)蛋白分子主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。 (3)成功構(gòu)建對(duì)MSCs具有高感染效率的雙基因表達(dá)腺病毒5型載體(Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1),酶切與序列測(cè)定結(jié)果顯示腺病毒載體構(gòu)建成功。 (4)原代培養(yǎng)的FBMSCs經(jīng)過(guò)差速貼壁傳代,第三代后細(xì)胞呈形態(tài)均一的長(zhǎng)梭形,成行排列;流式檢測(cè)顯示,細(xì)胞表面標(biāo)志CD_(106)、CD_(44)和CD_(29)等陽(yáng)性率均＞98%;HLA-DR、CD_(16)、CD_(34)、CD_(45)和CD_(19)等陽(yáng)性率均＜2%;未經(jīng)誘導(dǎo)的FBMSCs均不表達(dá)PDX1、NKX6.1、NGN3、GLUT2等轉(zhuǎn)錄因子。 (5)FBMSCs經(jīng)重組腺病毒Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1聯(lián)合下游相應(yīng)細(xì)胞因子分步誘導(dǎo),細(xì)胞相互聚集成胰島樣小體,雙硫腙染色細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性,RT-PCR顯示細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)目的基因Pdx1、Nkx6.1:聯(lián)合下游第Ⅱ階段細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,胰島素基因開(kāi)始表達(dá);當(dāng)聯(lián)合第Ⅲ階段細(xì)胞因子作用后,MafA與GLUT2開(kāi)始表達(dá),約10~5個(gè)細(xì)胞分泌的胰島素量達(dá)(340.4±59.3)mU/L;當(dāng)在高糖環(huán)境下,胰島素量達(dá)(639.8±85.1)mU/L。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)與間接熒光顯示Pdx1、Nkx6.1與所誘導(dǎo)表達(dá)的NGN3與MafA等轉(zhuǎn)錄因子均在靶細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),胰島素、C-肽與GLUT2主要位于細(xì)胞質(zhì)中;Western blotting檢測(cè)也證實(shí)PDX1、NKX6.1均持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),胰島素在誘導(dǎo)的第Ⅱ階段開(kāi)始表達(dá)。 (6)植入所誘導(dǎo)的細(xì)胞后第三天,糖尿病鼠血糖即可恢復(fù)正常水平,血糖穩(wěn)定可持續(xù)27天以上。HE染色顯示:細(xì)胞在腎包膜下多呈圓形,體積較大,胞漿豐富,嗜堿性,并有許多分泌泡樣結(jié)構(gòu),將核擠向一側(cè),提示細(xì)胞分泌功能活躍:免疫組化顯示細(xì)胞質(zhì)胰島素陽(yáng)性;間接熒光亦顯示細(xì)胞質(zhì)中胰島素與C-肽陽(yáng)性;兩對(duì)照組所移植的細(xì)胞均不能檢測(cè)到胰島素與C-肽。 結(jié)論: (1)成功構(gòu)建pEGFP-N1/Nkx6.1、pEGFP-N1/Pax4與pIRES-Pdx1/NeuroD1等質(zhì)粒載體,經(jīng)轉(zhuǎn)染證實(shí)目的基因具有細(xì)胞核定位等生物學(xué)功能;篩選并成功構(gòu)建具有協(xié)同效應(yīng)的Pdx1與Nkx6.1雙基因表達(dá)的腺病毒載體Adxsi.CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1。 (2)本研究以參照國(guó)內(nèi)外分離培養(yǎng)胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(FBMSCs)方法為基礎(chǔ),采用高壓生理鹽水灌沖并聯(lián)合密度梯度離心法分離,應(yīng)用差速貼壁篩選法進(jìn)一步分離、純化并擴(kuò)增FBMSCs,經(jīng)多次傳代后,細(xì)胞表面標(biāo)志與功能鑒定提示本法可以獲得相對(duì)較純的FBMSCs. (3)本研究在PDX1與NKX6.1作用的基礎(chǔ)上,聯(lián)合細(xì)胞因子分步誘導(dǎo)FBMSCs向分泌胰島素的B功能樣細(xì)胞分化,結(jié)果所誘導(dǎo)的細(xì)胞具有主動(dòng)攝取高濃度Zn~(2+),先后開(kāi)始表達(dá)NGN3、MafA、GLUT2等β細(xì)胞特征分子;合成并分泌高水平胰島素,且高濃度葡萄糖能刺激細(xì)胞分泌胰島素;進(jìn)一步在糖尿病模型鼠體內(nèi),該細(xì)胞具有降低血糖,并持續(xù)維持糖尿病鼠正常血糖的能力,改善STZ糖尿病大鼠的生存狀態(tài)。結(jié)果提示本誘導(dǎo)方案可有效誘導(dǎo)FBMSCs分化為分泌胰島素的β功能樣細(xì)胞。
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【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 王雅光;微囊化IPCs腎被膜移植治療小鼠糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2011年

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本文編號(hào)：1674998