發(fā)布時間：2018-03-26 03:09

  本文選題：噬菌體展示　切入點(diǎn)：血型A抗原　出處：《華中科技大學(xué)》2008年博士論文

【摘要】： 第一部分血型A抗原模擬多肽的篩選 目的: 篩選血型A抗原的模擬多肽。 方法: 用血型A抗體NaM87-1F6對噬菌體隨機(jī)12肽庫進(jìn)行三輪篩選,隨機(jī)挑選32個噬菌體克隆,經(jīng)噬菌體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、噬菌體微篩選鑒定噬菌體與抗體的結(jié)合力。測定特異性噬菌體DNA序列并推導(dǎo)其展示的多肽序列。凝集抑制試驗(yàn)檢測噬菌體展示多肽對血型A抗原的模擬作用。 結(jié)果: 1.經(jīng)三輪篩選和相應(yīng)的鑒定后得到7個抗A抗體NaM87-1F6的特異性噬菌體克隆。 2.其中6噬菌體(C5,22,23,26,27,31)展示的多肽序列為EYWYCGMNRTGC(將此多肽序列命名為P5,展示此多肽的噬菌體以C5為代表),另一噬菌體克隆C17展示的多肽序列為QIWYERTLPFTF(將此多肽序列命名為P17)。 3.凝集抑制試驗(yàn)提示展示這兩個多肽的噬菌體可以抑制A型紅細(xì)胞的凝集作用,陰性對照噬菌體原肽庫不能抑制這種凝集作用。 結(jié)論: 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,多肽EYWYCGMNRTGC,QIWYERTLPFTF可以模擬血型A抗原的表位。此兩種多肽具有建立新型診斷和親和濾除抗A抗體方法的潛能。 第二部分血型A抗原模擬多肽的GST融合表達(dá) 目的: 構(gòu)建表達(dá)血型A抗原模擬多肽的融合表達(dá)載體,鑒定融合表達(dá)蛋白模擬血型A抗原的能力。 方法: PCR擴(kuò)增血型A抗原模擬多肽(P5、P17)和谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼基因,并連接成P5-GST和P17-GST,雙酶切后重組入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28b,構(gòu)建質(zhì)粒pET28b-P5-GST和pET28b-P17-GST。通過酶切、測序鑒定重組子。以BL21(DE3)為表達(dá)菌,在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)P5-GST和P17-GST融合蛋白,Ni-NTA柱純化蛋白。競爭ELISA鑒定融合蛋白對噬菌體展示多肽抗原活性的模擬作用,紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)分析融合蛋白模擬血型A抗原的能力。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建P5、P17基因和GST基因融合后的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28b-P5-GST和pET28b-P17-GST。 2.P5-GST和P17-GST基因在宿主菌中高效表達(dá)并得到純化。 3.P5-GST和P17-GST蛋白以濃度依賴的方式抑制A型紅細(xì)胞的凝集作用。 結(jié)論: 原核表達(dá)的多肽融合蛋白P5-GST和P17-GST可模擬天然血型A抗原,具有替代天然A抗原用于發(fā)展新型抗A抗體檢測方法和濾除材料的潛能。 第三部分模擬多肽融合蛋白檢測血型抗體初步研究 目的: 探討多肽融合蛋白EYWYCGMNRTGC-GST和QIWYERTLPFTF-GST在血型A抗體檢測中的應(yīng)用價值。 方法: 收集多份健康獻(xiàn)血者血漿,試管凝集實(shí)驗(yàn)對血型抗體進(jìn)行ABO定型,滴度測定;用基于GST融合表達(dá)多肽EYWYCGMNRTGC(P5-GST),QIWYERTLPFTF(P17-GST)的ELISA方法檢測血型抗體;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較ELISA方法與經(jīng)典凝集試驗(yàn)檢測血型抗體的效能。 結(jié)果: 1.收集到120份健康獻(xiàn)血者血漿,其中90份為抗A抗體陽性,30份抗A抗體陰性。 2.基于P5-GST的ELISA檢測血漿抗A抗體實(shí)驗(yàn)受試者工作特性曲線的曲線下面積分別為0.873(P0.001),ELISA結(jié)果A值與凝集試驗(yàn)抗體滴度間的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.728(P0.001)�；赑5-GST的ELISA在閾值為0.280時其敏感度、特異度分別為80%和76.7%�；赑17-GST的ELISA未能顯示出具有檢測血型抗體A的效能。 結(jié)論: 基因工程多肽EYWYCGMNRTGC-GST融合蛋白具有一定的血型A抗體檢測能力,為開發(fā)新型的血型抗體檢測方法提供了思路。
[Abstract]:The screening of the first part of the mimic peptide of blood type A antigen
Objective:
Screening mimic peptides of blood type A antigen.
Method:
The phage random 12 peptide library by antibody of A type NaM87-1F6 three rounds of screening, 32 phage clones were randomly selected, the phage enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), the binding force of phage screening and identification of phage antibody and micro - Determination of specific phage DNA sequence and its deduced polypeptide sequence show. Agglutination inhibition test detection of phage display the simulation effect of polypeptide on blood group A antigen.
Result:
1. after three rounds of screening and corresponding identification, 7 specific phage clones of anti A antibody NaM87-1F6 were obtained.
2., of which 6 phage (C5,22,23,26,27,31) displayed polypeptide sequence was EYWYCGMNRTGC (the polypeptide sequence was named P5, the phage displayed the polypeptide represented by C5), and another phage clone C17 showed the polypeptide sequence was QIWYERTLPFTF (named the peptide sequence P17).
3. agglutination inhibition test showed that the phage displayed these two peptides could inhibit the agglutination of A type red blood cells. The negative control phage peptide library could not inhibit this agglutination.
Conclusion:
The results suggest that polypeptide EYWYCGMNRTGC and QIWYERTLPFTF can mimic the epitope of blood group A antigen. These two kinds of peptides have potential to establish new diagnostic and affinity filtration methods for anti A antibody.
GST fusion expression of second partial blood type A antigen mimic peptides
Objective:
To construct a fusion expression vector expressing the mimic peptide of blood type A antigen, and to identify the ability of the fusion protein to mimic the blood group A antigen.
Method:
The amplification of PCR blood group A antigen mimic peptide (P5, P17) and glutathione S- transferase (GST) gene encoding, and connected into P5-GST and P17-GST into prokaryotic expression recombinant plasmid pET28b digested plasmid pET28b-P5-GST and pET28b-P17-GST. by enzyme digestion, sequencing of recombinant BL21 (DE3). For the expression of bacteria, the expression of P5-GST and P17-GST fusion protein induced by IPTG, purified protein Ni-NTA column. Identification of ELISA fusion protein show competition simulation effect on the activity of phage peptide antigen, hemagglutination inhibition test analysis of blood group A antigen fusion protein simulation ability.
Result:
1. successfully constructed the prokaryotic expression plasmid pET28b-P5-GST and pET28b-P17-GST. of the fusion of P5, P17 and GST genes
2.P5-GST and P17-GST genes are highly expressed and purified in host bacteria.
3.P5-GST and P17-GST proteins inhibit the agglutination of A type red cells in a concentration dependent manner.
Conclusion:
The fusion protein P5-GST and P17-GST expressed in prokaryotic expression can simulate A antigen of natural blood group. It has potential to replace natural A antigen for developing new anti A antibody detection methods and filtering materials.
A preliminary study on the detection of blood group antibodies by third parts of simulated polypeptide fusion protein
Objective:
To explore the application value of polypeptide fusion protein EYWYCGMNRTGC-GST and QIWYERTLPFTF-GST in the detection of blood group A antibody.
Method:
Collect more health blood donors, blood type antibody ABO titer setting, agglutination test; with the expression of GST fusion peptide EYWYCGMNRTGC (P5-GST), based on QIWYERTLPFTF (P17-GST) ELISA blood group antibody detection method; statistical analysis and comparison of ELISA method and classical agglutination test for detection of antibody potency.
Result:
1. the blood plasma of 120 healthy blood donors was collected, of which 90 were anti A antibody positive and 30 anti A antibodies were negative.
The area of 2. ELISA based on the detection of plasma P5-GST anti A antibody test receiver operating characteristic curve under the curve was 0.873 (P0.001), ELISA results A value and the Spearman correlation coefficient between the agglutination antibody titers were 0.728 (P0.001). Based on the P5-GST ELISA in the threshold of 0.280 is its sensitivity, specificity respectively 80% and 76.7%. P17-GST ELISA could not show the ability to detect A antibodies based on efficiency.
Conclusion:
The gene engineering polypeptide EYWYCGMNRTGC-GST fusion protein has a certain ability to detect the blood type A antibody, which provides a way of thinking for the development of a new blood type antibody detection method.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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本文編號：1666068