本文選題：日本血吸蟲　切入點：兒茶酚胺類物質　出處：《安徽醫(yī)科大學》2009年博士論文

【摘要】：日本血吸蟲病預防主要在致病,感染和傳播三個方面,由于沒有臨床可用的抗血吸蟲病疫苗,化學治療聯合消滅中間宿主釘螺等方法的綜合治療是目前控制血吸蟲病的主要措施。吡喹酮是血吸蟲病化療的首選,由于其毒副作用小,價格低廉,殺血吸蟲效果較好,因而該藥被臨床或是疫區(qū)預防廣泛使用。但是其具體作用機制仍不明確,但是對慢性血吸蟲病患者的治愈率低,廣泛應用帶來的耐PZQ血吸蟲株報道時有出現。因此,加強抗血吸蟲化療藥物的研制或新的藥物作用靶點尋找刻不容緩。蟲卵沉積致肉芽腫是日本血吸蟲病最為主要致病因素,干預蟲卵產生成為抗血吸蟲病的重要途徑之一。兒茶酚胺類物質是蟲體本身重要的神經遞質,主要分布于神經節(jié),神經干等處酪氨酸經過一系列酶促反應生成兒茶酚胺類物質,其中合成的限速酶是酪氨酸羥化酶( tyrosine hydroxylase,TH),通過復雜的途徑調控兒茶酚胺類物質的合成,據報道,人14-3-3信號蛋白可以上調TH的表達,增強酶活性。在曼氏血吸蟲中,兒茶酚胺類物質與五羥色胺相互作用,影響曼氏血吸蟲的肌肉收縮和產卵率。那么在日本血吸蟲中是否存在兒茶酚胺類物質?是否有兒茶酚胺類物質合成的限速酶——酪氨酸羥化酶存在?是否存在不同信號通路調節(jié)酶的表達和/或活性?為此,本研究設計了一系列實驗驗證、分析上述推斷,最終試圖干預兒茶酚胺的合成,影響蟲體的發(fā)育、蟲卵產生及活動度等。 我們對不同物種(人,牛,大鼠,小鼠,鵪鶉,果蠅和曼氏血吸蟲)TH進行同源性比較,發(fā)現在近3′端同源性高。選擇保守區(qū)內SmTH CDS序列設計引物,以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板,RT-PCR擴增SjTH中間片段,獲得一個497bp的片段,經測序證實該中間片段與SmTH同源性達到87%,初步認為該序列為SjTH的一部分;進一步以此中間片段設計引物,通過RACE PCR分別擴增SjTH的5′端和3′端,并測序、拼接,發(fā)現兩端中間重疊片段與我們上述擴增的中間片段一致。利用NCBI提供的ORF finder在線分析拼接的SjTH序列,發(fā)現最長的SjTH長1392bp。據此ORF,設計用于擴增全基因的引物,再次進行PCR擴增,產物測序,兩次結果一致,因此我們運用RACE PCR成功獲得了SjTH的全編碼基因序列,該基因全長1392bp,Vector NTI生物軟件預測其編碼SjTH含有463個氨基酸,分子量53.97kDa,pI為5.81,分別再次作上述的同源性比較,與SmTH的同源性達75%,與人類TH為40%。同SmTH一樣,SjTH的保守區(qū)多位于近3′末端,在羧基末端存在一個14-3-3信號蛋白與靶蛋白相互作用的共同基序(RSXpSXP),因此,推測rSjTH可以與14-3-3相互作用。利用原核表達系統(tǒng)(pET28a/ BL21)表達出重組SjTH,His標簽純化融合蛋白,His單克隆抗體Western blotting分析蛋白免疫特性。用H3標記酪氨酸作為底物分析酶活性,發(fā)現rSjTH催化活性也需要二氫葉酸還原酶存在,且酶活性與二氫葉酸還原酶的量在一定范圍內相關。同時制備rSjTH的多克隆抗體, IIF分析發(fā)現蟲體內SjTH主要位于生殖器官,神經節(jié)和肌層。RT-PCR和Western blotting分析尾蚴和成蟲(雌雄成蟲)兩種不同發(fā)育階段的SjTH表達顯示,SjTH在日本血吸蟲成蟲階段表達量最高,其次是尾蚴,雌雄成蟲間表達無差異。綜上所述,我們成功擴增出SjTH編碼基因,初步分析SjTH蛋白氨基酸組成,同源性,酶活性,定位及在不同生活史階段表達變化。在蛋白近3′端發(fā)現與Sj14-3-3相互作用的一致性motif,推測該酶可以Sj14-3-3相互作用,為尋找調節(jié)酶活性變化的靶位奠定基礎。 吡喹酮(PZQ)是目前用于殺血吸蟲治療中應用最為廣泛的特效藥物,但有報道顯示,該藥對成蟲的效果優(yōu)于童蟲,對成熟蟲卵的效果優(yōu)于未成熟蟲卵,且殺蟲治療并不能阻止蟲卵肉芽腫導致的肝臟纖維化的進展。此外,抗蟲治療后并不能預防再感染。曼氏血吸蟲對PZQ抗藥性的產生使日本血吸蟲病的有效治療面臨極大的威脅。因此,新的抗血吸蟲藥物研究仍是十分重要的領域。血吸蟲寄生在宿主的需氧環(huán)境,如肝臟,肺和血液等。因此,NIH化學基因組學研究中心篩選了能夠抗氧化的化學復合物,發(fā)現兩種化合物,即phosphinic amides和oxadiazole 2-oxides(OX),它們的共同作用是抑制谷胱甘肽還原酶( thioredoxin glutathione reductase,TGR)活性。OX作用范圍窄,主要對曼氏血吸蟲有效;鈣通道阻滯劑被用來抑制血吸蟲雌蟲產卵,抑制雌蟲產卵不僅有效阻止了血吸蟲病肝纖維化的發(fā)展,也能有效減少傳染源,阻斷血吸蟲病的傳播。因此,抑制成蟲成熟和雌蟲蟲卵的藥物是抗血吸蟲新藥研發(fā)的重要切入點。 蟲卵在肝臟沉積,毛蚴釋放的可溶性蟲卵抗原( soluble eggs antigens,SEA)刺激機體引起的蟲卵肉芽腫是血吸蟲病患者致病最為重要的危險因素。兒茶酚胺類(catecholamine, CA)物質是高等動物重要的神經遞質,也是血吸蟲發(fā)育、寄生和附著的重要的神經遞質,可以降低肌肉緊張度,抑制雌蟲產卵。酪氨酸在限速酶酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)等一系列酶促反應作用下生成CA,其中限速酶TH是CA合成的調節(jié)點。在前述的研究中,我們在日本血吸蟲成蟲中成功克隆出SjTH的編碼基因,序列分析SjTH發(fā)現在羧基端存在Sj14-3-3結合的通用基序( motif )即“RSXpSXP”的短肽——YIRHHSRPMHTP。人工合成該磷酸化的短肽( phosphorylated YIRHHSRPMHTP),經BIAcore分析顯示,該磷酸化的短肽可以與Sj1-3-3信號蛋白特異性結合,推測Sj14-3-3可以與磷酸化的SjTH相互作用,這種相互作用是通過上述基序介導的。那么這種相互作用對TH活性是否有影響?已有報道:人類14-3-3和磷酸化的hTH相互作用后,hTH活化,活性增強,催化Tyr合成CA增加。在無脊椎動物日本血吸蟲體內,這種相互作用是否會產生同樣結果,尚不得而知。因此,我們在克隆出SjTH的基礎上,體外真核表達了SjTH,磷酸化后與重組Sj14-3-3相互作用,3H標記Tyr分析了SjTH酶活性變化。 根據前述克隆的SjTH編碼序列,設計pcDNA3.1(his-myc)表達系統(tǒng)引物,真核表達SjTH,利用his標簽純化融合蛋白,體外磷酸化SjTH,加入不同濃度的Sj14-3-3信號蛋白,SjTH活性在一定范圍內隨Sj14-3-3蛋白的加入,活性增強。上述實驗初步證明Sj14-3-3可以通過通用motif與SjTH結合,激活SjTH酶活性,終使兒茶酚胺類物質合成增加。這為下一步把SjTH和/或Sj14-3-3信號蛋白作為靶點,通過調節(jié)日本血吸蟲兒茶酚胺類物質合成,進而干預日本血吸蟲活動及雌蟲產卵奠定基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R383.2

【共引文獻】

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本文編號：1664939