發(fā)布時(shí)間：2018-03-24 22:36

  本文選題：IFN-λ1　切入點(diǎn)：畢赤酵母　出處：《中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文

【摘要】： IFN-λs是最新發(fā)現(xiàn)的一類具有抗病毒活性的干擾素樣細(xì)胞因子,包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。IFN-λs在基因結(jié)構(gòu)上與IL-10家族十分相似,而在氨基酸組成和功能方面與Ⅰ型IFN更為接近,在IL-10家族和Ⅰ型IFN之間建立了進(jìn)化上的聯(lián)系。因此IFN-λ1具有開發(fā)成抗病毒抗腫瘤藥物的潛在價(jià)值。 本組前期工作中通過RT-PCR從人外周血淋巴細(xì)胞中克隆了IFN-λ1 cDNA,通過基因重組及酵母表達(dá)技術(shù),已設(shè)計(jì)并表達(dá)了一種新的重組人干擾素λ1(IL-29)蛋白。前期工作表明,該重組蛋白能夠在畢赤酵母中正確分泌性表達(dá),具有能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)的STAT1磷酸化的生物學(xué)活性。本論文在此基礎(chǔ)上,對重組人干擾素λ1的表達(dá)純化,理化性質(zhì)鑒定,受體分布和抗腫瘤生物活性幾個方面進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。 本論文的第一部分工作是使用本組保存的含pAO815-4αF-IFNλ1表達(dá)質(zhì)粒的甲醇營養(yǎng)型酵母菌種,通過BMG培養(yǎng),在BMMY中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),其中低糖基化20kD rhIFN-λ1表達(dá)水平約為9.32mg/L,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SPFF陽離子交換層析及Superdex75分子篩層析純化,和HPLC鑒定,獲得較純的重組人IFN-λ1(recombinant humanIFN-λ1,rhIFN-λ1)蛋白。對純化程序作了產(chǎn)率,純度分析,并對重組蛋白作了質(zhì)譜,N端測序,等電點(diǎn)等理化性質(zhì)的鑒定。 IFN-λs受體隸屬于Ⅱ型細(xì)胞因子受體家族,由兩個亞基構(gòu)成,即IL-28R(或稱CRF2-12)和IL-10R2(或稱CRF2-4)。其中IL-28R是IFN-λs受體特有的亞基,CRF2-4最早是作為IL-10受體(IL-10R)的小亞基被發(fā)現(xiàn)的,故又稱為IL-10R2,同時(shí)IL-10R2還是IL-22R和IL-26R的共有亞基。本論文的第二部分工作是通過RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR)方法,對三個腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了IFN-λR復(fù)合物表達(dá)特異性的鑒定。RT-PCR檢測IL-28R在兩株實(shí)體瘤細(xì)胞株:人宮頸癌細(xì)胞株Hela及人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中均有表達(dá),但在骨髓造血系統(tǒng)來源的人淋巴瘤細(xì)胞株U937細(xì)胞中未檢測到表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對Hela、HCT116、U937細(xì)胞以各自的GAPDH為參照計(jì)算各自IL-28R基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示,Hela和HCT116細(xì)胞中IFN-λs特異的受體大亞基IL-28R的相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于U937中的相對表達(dá)量。 分別以Hela、HCT116及U937細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。MTT比色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IFN-λ1在10、100和1000ng/ml三個不同濃度對Hela細(xì)胞增殖的抑制率分別為15.20±4.73%,16.57±9.80%和25.88±12.48%;對HCT116細(xì)胞增殖的抑制率分別為11.62±10.08%,1.83±2.46%和21.22±6.48%,高于其對U937細(xì)胞增殖的抑制率11.46±3.48%,13.46±3.83%和8.87±2.73。相反,對照組IFN-α2a 1000IU/ml對U937細(xì)胞增殖的抑制率20.39±1.24%,高于其對于Hela和HCT116細(xì)胞增殖的抑制率7.25±1.58%和6.52±1.87%。因此IFN-λ1因其IL-28R表達(dá)水平和組織分布的特異性顯示了與IFN-α差異的抗腫瘤活性。 上述研究結(jié)果為促進(jìn)IFN-λ1的純化、性質(zhì)、功能的研究打下了基礎(chǔ),對其由于受體分布特異的原因可能較少抑制骨髓造血系統(tǒng)來源的細(xì)胞增殖提供了初步的依據(jù)。為了將rhIFN-λ1真正應(yīng)用于臨床的腫瘤治療中,還有更多關(guān)于制備工藝和動物實(shí)驗(yàn)的研究工作有待完成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R341;R96

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本文編號：1660353