發(fā)布時(shí)間：2018-03-23 22:09

  本文選題：心肌肥厚　切入點(diǎn)：雙孔鉀通道　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2010年博士論文

【摘要】：雙孔鉀通道(Two-pore-domain potassium channels, K2P通道)自上世紀(jì)90年代中期被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已經(jīng)引起了廣泛的研究興趣,而TREK-1(TWIK-Related K+channel-1)做為K2P家族中的一員,因其自身獨(dú)特的通道理化特性以及在體內(nèi)的廣泛分布,在近年來(lái)更是成為關(guān)注的焦點(diǎn)。TREK-1在大腦以及心臟等重要器官中有著較高水平的表達(dá),由此推測(cè)TREK-1在維持正常生理功能中可能起著十分重要的作用。隨著各種生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,TREK-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種功能逐漸被揭示,但由于缺乏針對(duì)TREK-1的特異性的阻斷劑,其在心肌細(xì)胞以及在腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中的具體功能還不明確。心肌肥厚引起的心律失常性猝死約占心肌肥厚死亡人數(shù)的三分之一,越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與心肌肥厚慢性階段相關(guān)的最一致的電生理變化就是動(dòng)作電位時(shí)程的延長(zhǎng),而TREK-1做為牽張激活的鉀通道和背景鉀通道在其中發(fā)揮的主要功能還不清楚。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)非興奮性細(xì)胞,其對(duì)維持神經(jīng)元活性正常至關(guān)重要,星形膠質(zhì)細(xì)胞的一些病理改變?nèi)缂?xì)胞腫脹,自由脂肪酸升高,細(xì)胞內(nèi)酸中毒等都是TREK-1的易感因素,而TREK-1是否存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞上還不明確。一些病理改變?nèi)缧募》屎衿陂gTREK-1的改變也還未見(jiàn)報(bào)道,TREK-1在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的電生理特性也尚未得到確認(rèn)。因此本研究中我們側(cè)重于正常條件下或是病理改變條件下大鼠心肌細(xì)胞和腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中與TREK-1相關(guān)的表達(dá)和功能研究,為進(jìn)一步闡明TREK-1在心臟和大腦中的具體功能并尋找新的藥物作用靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。 第一部分：大鼠心肌肥厚期間左心室內(nèi)膜TREK-1蛋白表達(dá)和電流的改變 1.異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型 采用大鼠連續(xù)頸背皮下注射異丙腎上腺素(5mg/kg)7天誘發(fā)左心室肥厚模型,結(jié)果顯示肥厚組大鼠心臟重量比對(duì)照組大鼠心臟重量增加44.9%；肥厚組大鼠心臟重量與體重比比對(duì)照組增加45.2%;肥厚組大鼠左心室壁厚度比對(duì)照組增加34.9%。以上結(jié)果表明大鼠連續(xù)頸背皮下注射異丙腎上腺素(5mg/kg)7天可成功誘發(fā)出左心室肥厚。 2大鼠,心肌肥厚時(shí)左心室內(nèi)膜雙孔鉀通道TREK-1蛋白表達(dá)的變化 采用蛋白免疫印跡雜交(western blot)的方法觀察心肌肥厚過(guò)程中大鼠左心室內(nèi)膜TREK-1蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示肥厚組大鼠左心室內(nèi)膜TREK-1的蛋白表達(dá)水平比對(duì)照組升高26.6%。以上結(jié)果提示心肌肥厚可以顯著上調(diào)大鼠心室肌內(nèi)膜細(xì)胞TREK-1的蛋白表達(dá)水平。 3心肌細(xì)胞TREK-1電流的確認(rèn) 3.1機(jī)械牽張(負(fù)壓)激活的大鼠心室肌細(xì)胞外向單通道電流 通過(guò)抽吸連接到一個(gè)壓力計(jì)的注射器來(lái)誘發(fā)機(jī)械牽張。結(jié)果顯示,在inside-out記錄模式下不給予細(xì)胞任何壓力刺激時(shí)很少能記錄到外向單通道電流,但是給予細(xì)胞膜片-30cmH2O的負(fù)壓刺激時(shí),可記錄到明顯的外向單通道開(kāi)放事件,而在撤除負(fù)壓刺激后,開(kāi)放的單通道電流幾乎被完全逆轉(zhuǎn)。-30cmH20激活的外向單通道的平均開(kāi)放概率約為0.064+0.01。以上結(jié)果表明負(fù)壓(機(jī)械牽張)可以激活心肌細(xì)胞上外向的單通道電流。 3.2細(xì)胞內(nèi)酸化作用激活的大鼠心室肌細(xì)胞外向單通道電流 觀察細(xì)胞內(nèi)酸化作用對(duì)心肌細(xì)胞外向單通道電流的影響,同時(shí)與CHO-TREK-1細(xì)胞內(nèi)的酸化作用作用進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示,在inside-out記錄模式下當(dāng)細(xì)胞外液的pH值為7.3時(shí),在心肌細(xì)胞記錄不到明顯的通道開(kāi)放而在CHO-TREK-1細(xì)胞上可以記到明顯的外向單通道電流。但當(dāng)細(xì)胞外液的pH值為6.8的時(shí)候,兩種細(xì)胞均可明顯記錄到外向單通道的開(kāi)放；當(dāng)細(xì)胞外液pH值為6.3的時(shí)候,兩種細(xì)胞上開(kāi)放的通道數(shù)目進(jìn)一步增加。細(xì)胞外液的pH值為6.8和6.3的時(shí)候心肌細(xì)胞上激活的外向單通道的平均開(kāi)放開(kāi)放概率分別為0.037±0.007和0.124±0.009；細(xì)胞外液的pH值為7.3、6.8和6.3的時(shí)候CHO-TREK-1上激活的外向單通道的平均開(kāi)放概率分別為0.068±0.002、0.1334-0.017和0.225±0.022。以上結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)的酸化作用可以激活心肌細(xì)胞上外向的單通道電流,且這一趨勢(shì)與細(xì)胞內(nèi)酸化作用對(duì)CHO-TREK-1的激活作用一致。 3.3花生四烯酸激活的大鼠心室肌細(xì)胞外向單通道電流 觀察花生四烯酸對(duì)大鼠心肌細(xì)胞外向單通道電流的影響。在inside-out記錄模式下10μM花生四烯酸可激活心肌細(xì)胞外向單通道電流,而CHO-TREK-1不需要給予花生四烯酸處理即可記錄到大量開(kāi)放的外向單通道電流。以上結(jié)果表明可以花生四烯酸可以激活心肌細(xì)胞上外向的單通道電流。 3.4心肌細(xì)胞TREK樣通道的單通道電導(dǎo) 根據(jù)上述記錄的兩種細(xì)胞不同電位下單通道平均擬合電流的大小計(jì)算出兩種通道的平均單通道電導(dǎo)分別為123±7pS (CHO-TREK-1)和113±17pS (cardiomyocyte),兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這里我們記錄到的心肌細(xì)胞TREK-1的單通道電導(dǎo)與文獻(xiàn)報(bào)道的TREK-1單通道電導(dǎo)范圍基本吻合 綜合上述四部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們記錄的外向單通道電流可以被負(fù)壓(機(jī)械牽張),細(xì)胞內(nèi)酸化作用以及花生四烯酸激活,而且單通道電導(dǎo)與CHO-TREK-1的單通道電導(dǎo)比較接近,由此可以證明我們?cè)谛募〖?xì)胞上所記錄到的外向單通道電流為心肌細(xì)胞TREK-1。 4.L-NBP對(duì)CHO-TREK-1、正常心肌細(xì)胞以及肥厚心肌細(xì)胞TREK-1單通道開(kāi)放概率的影響 應(yīng)用inside-out記錄技術(shù)觀察L-NBP對(duì)TREK-1的抑制作用。在inside-out記錄模式下CHO-TREK-1細(xì)胞中不需要給予任何處理即可記錄到大量開(kāi)放的TREK-1通道,給予10μM L-NBP作用5分鐘后,通道活性被明顯抑制但不能完全被逆轉(zhuǎn)。在正常心肌細(xì)胞和肥厚心肌細(xì)胞中,0.18mM的氯仿可激活爆發(fā)式的TREK-1通道丌放,給予10μM L-NBP處理5分鐘后通道丌放事件明顯減少,但仍不能完全被抑制。10μM L-NBP對(duì)CHO-TREK-1,正常心肌細(xì)胞TREK-1和肥厚心肌細(xì)胞TREK-1的抑制率分別為48.5+8%,54.3+3%和55.5+4%,三者之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明,0.18mM氯仿可以顯著激活心肌細(xì)胞TREK-1;10μM L-NBP對(duì)TREK-1有顯著的抑制作用,而且10μM L-NBP對(duì)三種細(xì)胞上TREK-1的抑制作用基本上一致。 5.L-NBP對(duì)正常心肌和肥厚心肌外向電流的影響 應(yīng)用全細(xì)胞記錄技術(shù)觀察TREK-1相對(duì)特異性阻斷劑L-NBP對(duì)正常心肌和肥厚心肌外向電流的影響。以10μM L-NBP抑制的外向電流大小作為一個(gè)參數(shù)來(lái)衡量正常心肌和心肌肥厚TREK-1的差別。在阻斷心肌細(xì)胞幾種主要類型的鉀電流的前提下,在全細(xì)胞記錄模式下正常心肌細(xì)胞中10μM L-NBP作用5分鐘可將外向全細(xì)胞電流從10.21±3.02pA/pF抑制為8.99±2.40pA/pF,而在肥厚心肌細(xì)胞中10μM L-NBP可將外向全細(xì)胞電流從7.43±1.72pA/pF抑制為5.73±1.75pA/pF。肥厚心肌細(xì)胞10μM L-NBP抑制的外向電流大小1.70±0.4pA/pF比正常心肌細(xì)胞10μML-NBP抑制的電流外向大小1.22±0.36pA/pF顯著升高。上述結(jié)果提示L-NBP對(duì)肥厚心肌細(xì)胞TREK-1電流的抑制率明顯高于正常心肌細(xì)胞。 6.氯仿對(duì)正常心肌和肥厚心肌外向電流的作用 應(yīng)用全細(xì)胞記錄技術(shù)觀察TREK-1特異性激活劑氯仿對(duì)正常心肌和肥厚心肌外向電流的影響。以0.18mM的氯仿激活的外向電流大小作為一個(gè)與10μM L-NBP抑制的外向電流大小完全相反的參數(shù)來(lái)衡量正常心肌和心肌肥厚TREK-1的差別。在阻斷心肌細(xì)胞幾種主要類型的鉀電流的前提下,在全細(xì)胞記錄模式下正常心肌細(xì)胞中0.18mM氯仿作用5分鐘可將外向全細(xì)胞電流從6.47±2.13pA/pF增加為8.89±2.38pA/pF,而在肥厚心肌細(xì)胞中0.18mM氯仿可將外向全細(xì)胞電流從6.04±1.57pA/pF增加為9.47±2.16pA/pF。肥厚心肌0.18mM氯仿誘發(fā)的外向電流大小3.43±0.7pA/pF比正常心肌0.18mM氯仿誘發(fā)的電流大小2.42±0.5pA/pF顯著升高。上述結(jié)果提示氯仿對(duì)肥厚心肌細(xì)胞TREK-1電流的激活作用明顯高于正常心肌細(xì)胞。 上面兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示肥厚心肌TREK-1電流與正常心肌TREK-1電流相比有增高的趨勢(shì),這個(gè)結(jié)果與前面的TREK-1的蛋白表達(dá)結(jié)果一致。 第二部分：大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞TREK樣通道的電生理確認(rèn) 1.花生四烯酸和氯仿激活的TREK樣外向單通道 觀察花生四烯酸和氯仿對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞外向單通道電流的影響。結(jié)果顯示,在inside-out記錄模式下10μM花生四烯酸和0.2M氯仿可顯著激活星形膠質(zhì)細(xì)胞外向單通道電流。10μM花生四烯酸和0.2Me1氯仿激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞外向單通道的平均開(kāi)放概率分別為0.173+0.01和0.255±0.02。 根據(jù)不同電位下記錄的花生四烯酸或氯仿激活的單通道平均擬合電流大小計(jì)算出該通道的平均單通道電導(dǎo)為107±16pS,與文獻(xiàn)報(bào)道的TREK-1單通道電導(dǎo)范圍基本吻合。上述結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞上存在可被花生四烯酸和氯仿激活的外向鉀通道,且該通道的電導(dǎo)與TREK-1比較接近。 2.機(jī)械牽張的影響 通過(guò)抽吸連接到一個(gè)壓力計(jì)的注射器來(lái)誘發(fā)機(jī)械牽張。結(jié)果顯示,在inside-out記錄模式下不給予細(xì)胞任何壓力刺激時(shí)很少能記錄到外向的單通道電流,但是給予細(xì)胞膜片-30cmH2O的負(fù)壓刺激時(shí),可記錄到明顯的外向單通道開(kāi)放事件,而在撤除負(fù)壓刺激后,開(kāi)放的單通道電流幾乎被完全逆轉(zhuǎn)。-30cmH2O激活的外向單通道的平均開(kāi)放概率約為0.142±0.02。以上結(jié)果表明負(fù)壓(機(jī)械牽張)可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞上外向的單通道電流。 3.細(xì)胞內(nèi)酸化作用的影響 觀察細(xì)胞內(nèi)酸化作用對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞外向單通道電流的影響。結(jié)果顯示,在inside-out記錄模式下當(dāng)細(xì)胞外液的pH值為6.8的時(shí)候,可明顯記錄到外向單通道的丌放；當(dāng)細(xì)胞外液pH值為6.3的時(shí)候,星形膠質(zhì)細(xì)胞上開(kāi)放的通道數(shù)目進(jìn)一步增加。細(xì)胞內(nèi)的酸化作用可以呈pH值依賴性的增加外向通道的平均開(kāi)放概率。在+60mV下細(xì)胞外液的pH值為6.8和6.3的時(shí)候星形膠質(zhì)細(xì)胞上激活的外向單通道的平均丌放開(kāi)放概率分別為0.064±0.01和0.176-0.01。以上結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)的酸化作用可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞上外向的單通道電流。 綜合上面三部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,星形膠質(zhì)細(xì)胞上的外向單通道可以被花生四烯酸和氯仿激活,可以被機(jī)械牽張(負(fù)壓)激活,同時(shí)也能被細(xì)胞內(nèi)的酸化作用激活,而且該外向通道的單通道電導(dǎo)與TREK-1的單通道電導(dǎo)比較接近,由此可以證明星形膠質(zhì)細(xì)胞上存在野生型的TREK-1通道。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R3411

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4 林代華;張志s，

本文編號(hào)：1655400