本文選題：血液血管干細(xì)胞　切入點(diǎn)：BL-CFC　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文

【摘要】： 造血細(xì)胞的起源一直是造血發(fā)育研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。其中一種觀點(diǎn)認(rèn)為造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞起源于共同的前體細(xì)胞:血液血管干細(xì)胞(hemangioblast)。1997年Keller等在小鼠胚胎干細(xì)胞建立的BL-CFC(blast-colony forming cell)是最早證實(shí)該細(xì)胞存在的模型,目前已廣泛應(yīng)用于血液血管干細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控研究。之后,Keller等在E7.5小鼠胚胎發(fā)現(xiàn)BL-CFC的存在。近期,我們的研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎定向造血的起源部位AGM區(qū)亦存在類似血液血管干細(xì)胞的前體HPP-HA。然而,目前有關(guān)AGM區(qū)是否存在真正的BL-CFC仍然未知。 本研究首先在小鼠胚胎AGM區(qū)建立了更精細(xì)的BL-CFC模型。取E9.5-E12.5小鼠胚胎AGM區(qū),消化成單細(xì)胞后進(jìn)行半固體集落培養(yǎng)。在bFGF、SCF、VEGF、IL-6、IGF-I和LIF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子的共同作用下培養(yǎng)3-5天后,可形成一種特殊形態(tài)的母細(xì)胞樣集落,其形態(tài)和分化特征與小鼠胚胎干細(xì)胞來源的BL-CFC集落相似。將培養(yǎng)4-5天的集落轉(zhuǎn)入液體擴(kuò)增體系進(jìn)行造血和血管的誘導(dǎo)分化,4天后收集單個(gè)集落來源的非貼壁細(xì)胞接種于造血祖細(xì)胞檢測(cè)體系。結(jié)果表明:BL-CFC產(chǎn)生CFU-E、CFU-GM、CFU-Mix以及HPP的頻率分別是100%、92%、92%和50%。同時(shí),貼壁細(xì)胞換EGM2內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo),10-15天時(shí)可見大量鵝卵石樣內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維樣平滑肌細(xì)胞。隨后進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)和體內(nèi)、體外成血管功能檢測(cè),結(jié)果表明:貼壁細(xì)胞高比例的吞噬LDL,表達(dá)CD31和vWF等內(nèi)皮細(xì)胞特異性表面標(biāo)志,不表達(dá)CD45和F4/80等造血相關(guān)標(biāo)志;表達(dá)血管平滑肌標(biāo)志SMA和周細(xì)胞標(biāo)志calponin;在體外Matrigel上可形成血管樣結(jié)構(gòu),呈網(wǎng)絡(luò)狀生長(zhǎng);制備成Matrigel plug植入裸鼠皮下,可觀察到外源性血管樣結(jié)構(gòu),表明其具有體內(nèi)成血管功能。而后,將野生型雄鼠(Sry+)和GFP+雌鼠(Sry-)胚胎AGM區(qū)細(xì)胞混合接種BL-CFC,隨機(jī)挑取BL-CFC集落用PCR方法檢測(cè)基因組DNA中Sry和GFP基因的存在。結(jié)果顯示:所挑取的BL-CFC集落均表達(dá)單一標(biāo)記(Sry或GFP),證實(shí)了BL-CFC為單克隆源性。模型優(yōu)化后發(fā)現(xiàn):bFGF和SCF對(duì)于集落生長(zhǎng)最重要,其次是IL-6。另外,我們還在臍動(dòng)脈(與AGM區(qū)平行產(chǎn)生HSC的大血管)檢測(cè)到BL-CFC的分布,而同期的胚胎循環(huán)血卻未發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):BL-CFC在臍動(dòng)脈均勻分布于其胚胎近端和遠(yuǎn)端。因此,BL-CFC更可能是在臍動(dòng)脈原位產(chǎn)生,而非通過血液或從背主動(dòng)脈遷移而來。 BL-CFC在AGM區(qū)發(fā)育動(dòng)力學(xué)的研究結(jié)果表明:E9.5胚胎的BL-CFC含量為19±2, E10.5時(shí)達(dá)到高峰(125±8/胚胎),之后逐漸下降,E12.5時(shí)為20±10/胚胎。之后對(duì)BL-CFC的空間分布進(jìn)行了考察,結(jié)果表明:AGM區(qū)的BL-CFC幾乎全部集中在AoM區(qū)。利用流式或磁珠分離AGM區(qū)細(xì)胞后進(jìn)行BL-CFC培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其全部集中在CD31+和Tie2+細(xì)胞亞群。 為進(jìn)一步研究小鼠胚胎AGM區(qū)血液血管干細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控,我們用AGM區(qū)細(xì)胞體外孵育的方法考察了多種與造血發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)因子,包括:IL-3、bFGF、IL-6、Epo、TPO、GM-CSF、SCF、OSM、VEGF等。結(jié)果表明:只有bFGF與IL-3可明顯擴(kuò)增AGM區(qū)的BL-CFC,前者擴(kuò)增2.1±0.8倍,與已有文獻(xiàn)一致;而IL-3的擴(kuò)增作用較bFGF更強(qiáng),為3.3±0.8倍。IL-3擴(kuò)增BL-CFC的作用呈濃度依賴性,隨著IL-3孵育濃度的增加,BL-CFC集落的數(shù)目逐漸增多;另外,隨著AGM區(qū)細(xì)胞在體外孵育時(shí)間的延長(zhǎng)BL-CFC數(shù)目會(huì)逐漸下降;而加入IL-3孵育6h時(shí)BL-CFC的數(shù)目就較0h有所擴(kuò)增,12h擴(kuò)增作用更加明顯,24h后BL-CFC的數(shù)目已較0h組顯著減少;另外,從總體分析,IL-3孵育后的BL-CFC數(shù)目均較與其同期孵育組顯著增加。集落誘導(dǎo)分化的結(jié)果顯示:IL-3孵育后BL-CFC的各系造血分化功能增強(qiáng),貼壁細(xì)胞在體外Matrigel上形成的管的數(shù)目和長(zhǎng)度均有所增加。另外,IL-3中和抗體可有效拮抗AGM區(qū)BL-CFC的發(fā)育,表明內(nèi)源性IL-3在BL-CFC的發(fā)育中起重要作用。 為考察IL-3是否也可調(diào)控原始造血發(fā)育,我們首先用RT-PCR檢測(cè)各型IL-3受體在小鼠E7.5胚胎的表達(dá)情況。結(jié)果表明:與E10.5的AGM區(qū)細(xì)胞相似,IL-3的各型受體βC、βIL-3和IL-3Rα均表達(dá)于E7.5的胚胎細(xì)胞。體外孵育后發(fā)現(xiàn):IL-3同樣可擴(kuò)增E7.5的各類造血CFC,其中:總CFC擴(kuò)增4.7±0.8倍,而EryP-CFC、Mac-CFC和EPM-CFC的擴(kuò)增倍數(shù)分別為4±1、6.9±2.8和5.6±1.2。此外,IL-3孵育后各系CFC的擴(kuò)增倍數(shù)之間無顯著差異,即:IL-3對(duì)原始造血各系CFC的擴(kuò)增是非系特異性的。 我們從增殖、凋亡和基因表達(dá)等多個(gè)方面初步考察了IL-3擴(kuò)增胚胎造血發(fā)育的相關(guān)機(jī)理。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn):IL-3可以促進(jìn)AGM區(qū)細(xì)胞的增殖,但并非特異性針對(duì)CD31+細(xì)胞群;同時(shí),它還可抑制AGM區(qū)細(xì)胞包括CD31+細(xì)胞亞群的凋亡。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明:IL-3可以改變AGM區(qū)和E7.5胚胎細(xì)胞的多個(gè)造血和內(nèi)皮相關(guān)的基因表達(dá)。IL-3孵育E7.5胚胎細(xì)胞時(shí)可見Scl、Runx1、Gata-1和vWF的顯著上調(diào),而Flk-1的表達(dá)則下調(diào);而IL-3孵育E10.5胚胎細(xì)胞后僅Scl和vWF的表達(dá)顯著上調(diào),而Flk-1和Runx1的表達(dá)顯著下調(diào)。Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-3可增加AGM區(qū)細(xì)胞STAT5和Erk1/2的磷酸化水平,且Jak2和MEK1/2的特異抑制劑AG490和PD98059分別可顯著抑制IL-3對(duì)AGM區(qū)BL-CFC的擴(kuò)增效應(yīng)。上述結(jié)果表明:IL-3可通過JAK-STAT和MAPK信號(hào)通路發(fā)揮其調(diào)控BL-CFC的作用。 總之,本研究在小鼠胚胎AGM區(qū)建立了經(jīng)典的血液血管干細(xì)胞模型BL-CFC,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了準(zhǔn)確和細(xì)致的考察。應(yīng)用上述模型,我們拓寬了對(duì)IL-3造血調(diào)控功能的認(rèn)識(shí),即:IL-3既可促進(jìn)雙向血液血管干細(xì)胞產(chǎn)生和分化,又可刺激早期胚胎原始造血。上述結(jié)論為今后優(yōu)化胚胎干細(xì)胞造血和血管分化體系提供了有益的啟示。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1654162