本文選題：創(chuàng)傷弧菌　切入點：外膜蛋白　出處：《福建師范大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio Vulnificus)FJ03-X2菌株為本研究室分離、鑒定、保種,屬于創(chuàng)傷弧菌Ⅰ型菌株,是歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)的致病菌。該菌株具溶血活性和酪蛋白酶活性,對歐鰻幼鰻(約30克/尾)的半數(shù)致死劑量(LD_(50))約為7.1×10~3CFU/尾,并已利用16S rDNA序列比較分析及創(chuàng)傷弧菌溶血素特異性Nested-PCR進(jìn)行了聯(lián)合鑒定。 首先本研究分別采用不同的方法分離創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白(outer membraneproteins,OMP),比較了各種方法的提取效果,篩選最佳的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白提取方法。制備了兔抗創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2全菌血清,并應(yīng)用SDS-PAGE和Western-blotting分析比較了兩種方法提取的外膜蛋白的組分和抗原性。SDS-PAGE結(jié)果表明,Sarkosyl法分離的主要外膜蛋白相對分子量集中在66～14kDa之間;相對分子量為38kDa、36kDa的外膜蛋白為高豐度蛋白。用兔抗全菌高免血清進(jìn)行的Western-blotting結(jié)果顯示,抗血清能識別絕大多數(shù)外膜蛋白組分,說明FJ03-X2菌株的外膜蛋白具有良好的抗原性。其中相對分子量分別為66kDa、47kDa、44kDa、38kDa、36kDa、34kDa的外膜蛋白呈強陽性反應(yīng),是主要的免疫原組分。同時對創(chuàng)傷弧菌在不同培養(yǎng)條件下的外膜蛋白產(chǎn)量進(jìn)行了比較分析,結(jié)果說明創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白產(chǎn)量與溫度和時間存在直接相關(guān)性。 其次本研究制備出創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白(OMP)免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)亞單位疫苗,腹腔注射免疫歐鰻,間接ELISA法測得免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d所采集的血清抗體效價分別為1:100、1:3200、1:6400、1:12800、1:3200、1:1600,歐鰻的血清抗體應(yīng)答水平先呈現(xiàn)上升趨勢,免疫后第28d達(dá)到峰值,之后開始下降;但是在第42d仍能檢測到相應(yīng)抗體。同時在第28d用創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行攻毒,OMP-ISCOMs免疫組的免疫保護(hù)力可達(dá)到100%;而OMPs免疫組的免疫保護(hù)力為70%;對照組全部死亡;說明OMP-ISCOMs具有很強的免疫原性,能誘導(dǎo)歐鰻產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)性。這與第28d歐鰻血清抗體水平最高也是一致的。免疫印跡結(jié)果顯示,在印跡膜上對應(yīng)的位置可檢測到OMP的4條主要蛋白條帶且免疫反應(yīng)性強,其相對分子量分別為47kDa、38kDa、36kDa、34kDa。上述試驗結(jié)果提示,創(chuàng)傷瘓，

本文編號：1650689