本文選題：丙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：核酶　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是引起人類丙型肝炎的病原體。全球HCV的感染率約為3%,近1.7億人感染HCV[1]。我國約為5000萬人,并且年發(fā)病人數(shù)呈高速上升趨勢,2009年發(fā)病人數(shù)比2003年上升了534%,達(dá)到131849人。HCV感染易慢性化[2],其慢性化率可高達(dá)70%,部分慢性丙型肝炎患者最終可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化,甚至肝細(xì)胞癌。目前臨床上主要采用干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療丙型肝炎,但該療法并非對所有慢性丙型肝炎患者均有效,約50%患者不能產(chǎn)生持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR),其中I型HCV感染患者SVR率最低[3, 4]。因此,亟需尋找新的抗HCV藥物靶點(diǎn)和研制新的抗HCV藥物。長期以來,由于一直缺乏有效的HCV體外培養(yǎng)模型和小動物模型嚴(yán)重阻礙了HCV致病機(jī)制的研究、抗HCV藥物體內(nèi)作用效果的評價和保護(hù)性疫苗的研發(fā)。因此探索建立有效的HCV模型,包括HCV體外培養(yǎng)細(xì)胞模型和HCV小動物模型,具有十分重要的意義。 就目前國內(nèi)外的研究成果來看,HCV體外培養(yǎng)細(xì)胞模型主要采用的是2005年日本學(xué)者Wakita等人[5]建立的體外轉(zhuǎn)錄模型,該模型存在操作繁瑣、穩(wěn)定性差等缺陷,限制了它的應(yīng)用。HCV小動物模型進(jìn)展比較緩慢,比較成功的是人肝嵌合uPA-SCID小鼠模型[6],但是由于該小鼠出生時肝臟損傷嚴(yán)重,致使成活率較低,而用于移植的人肝又不易獲得,這使該模型局限于少數(shù)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用,無法滿足日趨緊迫的HCV研究的需要。 正是基于以上的原因,本研究建立了一種基于核酶自剪切機(jī)制的穩(wěn)定分泌HCV細(xì)胞模型,并用核酶自剪切載體對HCV小鼠模型進(jìn)行了探索性研究。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下: 1、HCV蛋白多克隆抗體的制備。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,原核表達(dá)六個HCV不同的蛋白片段,以表達(dá)純化的蛋白為抗原,分別免疫新西蘭大耳白兔,收集血清,制得六個針對HCV不同蛋白片段的多克隆抗體。 2、HCV核心蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,在真核表達(dá)載體pEGFP-N1多克隆位點(diǎn)(MCS)前引入原核啟動子lac promoter序列,得到穿梭表達(dá)載體pEGFP-N1-lac,再把PCR擴(kuò)增出的HCV核心蛋白序列(573bp)插入到構(gòu)建的穿梭表達(dá)載體MCS區(qū),得到重組質(zhì)粒pEGFP-N1-lac-core,該質(zhì)粒在原核細(xì)胞(E.coli)和真核細(xì)胞(HepG2)中均能表達(dá)HCV核心蛋白,可以作為實(shí)驗(yàn)中HCV蛋白檢測的陽性對照。 3、重組質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB的構(gòu)建。應(yīng)用突變PCR的方法,在原始克隆pJFH1/GDD的HCV全長基因組cDNA的兩端各加入一個核酶序列,并通過合適的酶切位點(diǎn)把兩端含有核酶的HCV全長cDNA連接到真核表達(dá)載體pEGFP-N1的CMV啟動子下游,得到目的質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB。此外,將上述重組質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB中HCV NS5B基因(編碼產(chǎn)物為RNA依賴的RNA聚合酶)中GDD的堿基序列突變?yōu)镚ND,使表達(dá)產(chǎn)物失去RNA聚合酶活性,得到陰性對照質(zhì)粒pJFH1/GND-2RB。 4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選。pJFH1/GDD-2RB及其對照質(zhì)粒pJFH1/GND-2RB轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,加入G418溶液至終濃度為0.7mg/ml(為預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳篩選濃度),對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行加壓篩選。2個星期后,每孔均有大量細(xì)胞死亡,但是整合入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞存活下來并分裂增殖。隨后采用有限稀釋法把存活下來的細(xì)胞倍比稀釋鋪于96孔板,最后挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),其中pJFH1/GDD-2RB穩(wěn)定克隆命名為HepG2/GDD,pJFH1/GND-2RB穩(wěn)定克隆命名為HepG2/GND。 5、細(xì)胞培養(yǎng)上清中HCV RNA的檢測。根據(jù)深圳匹基公司HCV PCR熒光定量檢測試劑盒操作流程,提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的RNA,提取的RNA經(jīng)RNase-freeDNase I處理,以去除基因組DNA的污染。然后經(jīng)過酚抽得到純凈的RNA,按照試劑盒配制25μl反應(yīng)體系,應(yīng)用Roche Lightcycler 2.0完成反應(yīng)。結(jié)果顯示HepG2/GDD培養(yǎng)上清中含有HCV RNA,參照標(biāo)準(zhǔn)品,其滴度達(dá)到1x107,陰性對照(HepG2/GND培養(yǎng)上清)和空白對照(水)中均沒有檢測到HCV RNA。 6、間接免疫熒光檢測HCV核心蛋白的表達(dá)。消化細(xì)胞HepG2/GDD和原始HepG2細(xì)胞(空白對照),鋪于抗原片上,待細(xì)胞貼壁后,用37℃預(yù)溫的1×PBS洗3次,每次10min,然后用4%的多聚甲醛(PBS稀釋)室溫固定30min,洗滌(洗滌方式同上)。再用0.2% Triton X-100(PBS稀釋)浸泡5min以增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性,洗滌。用山羊血清室溫封閉固定好的細(xì)胞30min,PBS清洗后,加入1:400稀釋的抗HCV核心蛋白單抗,37℃孵育1h,洗滌,加入1:1000稀釋的FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37℃避光孵育1h,洗滌后加入含有DAPI(4',6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)的封片劑,熒光倒置顯微鏡下觀察到HepG2/GDD細(xì)胞胞漿區(qū)域有較強(qiáng)熒光出現(xiàn),而空白對照則無此現(xiàn)象,由此表明,HepG2/GDD細(xì)胞中有HCV核心蛋白表達(dá)。 7、蛋白免疫印跡檢測HCV核心蛋白的表達(dá)。收集HepG2/GDD和原始HepG2細(xì)胞,裂解緩沖液裂解后離心取上清,按照4:1的體積比加入5倍上樣緩沖液,沸水浴15分鐘。上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,之后轉(zhuǎn)至PVDF(聚偏氟乙烯膜)膜上,5%脫脂牛奶37℃封閉2h,抗HCV核心蛋白單抗4℃孵育過夜,HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37℃孵育1h,ECL顯色,暗室內(nèi)曝光于膠片上,觀察到HepG2/GDD泳道有條帶產(chǎn)生,大小與陽性對照相似,而空白對照(HepG2細(xì)胞)無條帶呈現(xiàn)。 8、HCV病毒顆粒的電鏡觀察。收集HepG2/GDD細(xì)胞培養(yǎng)上清(約15ml),慢慢攪動并加入NaCl至終濃度0.5mol/L,再加入PEG6000至終濃度為10%,4℃過夜。8000rpm離心30min,收集沉淀,溶于100μl PBS中。用細(xì)滴管吸取一滴樣品懸液,滴于銅網(wǎng)上,進(jìn)行負(fù)染操作。完成負(fù)染后,置于電子顯微鏡(Philips, TECNAI-10)下,觀察到HCV顆粒,直徑約為55nm。 9、干擾素治療。把HepG2/GDD細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入不同劑量的IFN-α至終濃度為10U/ml、100U/ml、500U/ml。3d后收集細(xì)胞上清,提取RNA,實(shí)時定量PCR檢測病毒滴度,發(fā)現(xiàn)病毒滴度隨干擾素濃度升高而降低,預(yù)示該細(xì)胞模型可以用來抗HCV藥物的篩選。10、HCV轉(zhuǎn)染小鼠模型探索研究。通過高壓水動力法把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C57小鼠肝臟細(xì)胞,3天后處死小鼠,收集血清并取肝。用實(shí)時定量PCR的方法沒有檢測到血清中含有HCV RNA,免疫組化檢測小鼠肝臟中HCV核心蛋白發(fā)現(xiàn),在血管周圍細(xì)胞中有HCV核心蛋白表達(dá)。 通過上述一系列的研究,我們成功構(gòu)建了質(zhì)粒pJFH1/GDD-2RB,通過把該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,然后G418加壓篩選,獲得了整合有該質(zhì)粒的細(xì)胞系HepG2/GDD,該細(xì)胞系能夠有效表達(dá)HCV核心蛋白,實(shí)時定量PCR檢測上清液中HCV滴度達(dá)到1×10~7,電鏡觀察HCV直徑為55nm。應(yīng)用經(jīng)IFN-α治療發(fā)現(xiàn)上清液中病毒滴度隨干擾素-α濃度的升高而降低。在隨后開展的HCV轉(zhuǎn)染小鼠模型探索研究中發(fā)現(xiàn),小鼠血清中沒有HCV顆粒,但是免疫組化證明,小鼠肝細(xì)胞中有HCV核心蛋白的表達(dá),這為我們深入開展小鼠模型研究打下良好的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 羅嬋,湯剛彬,謝體三,石德順;感受態(tài)細(xì)胞制備與保存方法的比較研究[J];生物技術(shù);2005年01期

2 Jean Dubuisson;;Hepatitis C virus proteins[J];World Journal of Gastroenterology;2007年17期

3 Dina Kremsdorf;Nicolas Brezillon;;New animal models for hepatitis C viral infection and pathogenesis studies[J];World Journal of Gastroenterology;2007年17期

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本文編號：1644151