本文選題：HIV-1　切入點(diǎn)：中和表位　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 自從1981年發(fā)現(xiàn)艾滋病以來,艾滋病已在全世界范圍流行,成為嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。目前,宣傳教育、行為干預(yù)以及抗病毒藥物治療等措施在防控艾滋病中發(fā)揮了重要作用。然而,有效的疫苗將在艾滋病的防控中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。由于HIV具有高度變異、攻擊免疫系統(tǒng),造成持續(xù)感染和誘發(fā)免疫病理損傷的特點(diǎn),使該疫苗的研制遭遇了前所未有的困難。使用能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HIV主要亞型病毒起保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原做疫苗靶抗原是HIV疫苗研發(fā)的首要策略,確定這類抗原是HIV疫苗研究關(guān)鍵而艱巨的工作。二十多年來,這方面的研究尚無明顯突破。使用HIV主要中和抗原Env和主要細(xì)胞免疫抗原Gag等為疫苗的臨床實(shí)驗(yàn)均告失敗,更說明研究確定HIV疫苗靶抗原的關(guān)鍵性和艱巨性。 與近些年來使用一種或多種完整的或修飾過的Env為HIV疫苗重要靶抗原的研究策略不同,本研究嘗試了使用Env中具有一定廣譜中和活性的HIV非主要中和抗原表位或稱在自然感染過程中不能發(fā)揮明顯保護(hù)作用的弱中和抗原表位做靶抗原的HIV疫苗研究新策略。鑒于這些抗原表位的免疫原性均較弱,本研究提出:若使用這類抗原作疫苗,一定要設(shè)法誘發(fā)出針對(duì)這類抗原的強(qiáng)免疫反應(yīng),否則不能有效識(shí)別自然感染過程中這類弱保護(hù)性抗原,也就不能有效抵抗這類病毒感染。即:誘發(fā)針對(duì)這類抗原的強(qiáng)免疫反應(yīng),可能是研制成功這類病毒疫苗的關(guān)鍵所在。這一設(shè)想是否正確,需要實(shí)驗(yàn)證明。如何來證實(shí)這個(gè)設(shè)想,就成了本研究要解決的中心問題。 本研究的思路是:為了增強(qiáng)HIV-1交叉中和表位的免疫原性,將HIV-1三個(gè)具有一定廣譜中和活性的線性抗原表位ELDKWA(簡(jiǎn)稱2F5)、NWFDIT(簡(jiǎn)稱4E10)和GPGRAFY(簡(jiǎn)稱447-52D)的編碼基因分別融合到能高效表達(dá)外源抗原表位的HBV S基因3'末端,選用佐劑效應(yīng)不同的載體分別表達(dá)這類抗原,通過這類抗原單獨(dú)或者幾種不同類型疫苗的聯(lián)合免疫,在小鼠模型中造成針對(duì)這類抗原強(qiáng)度不同的免疫狀態(tài),對(duì)其誘生的結(jié)合抗體和中和抗體水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要結(jié)果如下: 第一、構(gòu)建了分別表達(dá)HBV S抗原與HIV交叉中和表位的四種融合基因的天壇株重組痘苗病毒疫苗,分別命名為RVJ1175S-2F5、RVJ1175S-4E10、RVJ1175S-44752D和RVJ1175S-串聯(lián)表位(前述三種表位的串聯(lián)體),PCR和測(cè)序結(jié)果表明,這四種融合基因序列正確重組到痘苗病毒TK區(qū),免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,HBV S抗原均可在Hela細(xì)胞中很好的表達(dá)。HBsAg的ELISA檢測(cè)表明這四種融合蛋白有效表達(dá)并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清液中。 第二、使用上述四種重組痘苗病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)分離純化制備了四種相應(yīng)的蛋白亞單位疫苗PS-2F5、PS-4E10、PS-447-52D和PS-串聯(lián)表位,SDS-PAGE顯示四種純化后的融合蛋白均含分子量為23kD和27kD兩種典型HBsAg條帶,Western blot證明這兩個(gè)條帶均能與HBsAg抗體反應(yīng),并分別能與三種表位相應(yīng)的HIV-1單抗2F5、4E10和447-52D反應(yīng)。 第三、構(gòu)建了包含HBV S抗原與HIV交叉中和表位四種融合基因的復(fù)制型DNA疫苗,限制性內(nèi)切酶酶切和序列測(cè)定確定了這四個(gè)質(zhì)粒的正確性,ELISA確定了pSCA中插入S-2F5、S-4E10、S-447-52D和S-串聯(lián)表位基因均能在Hela中有效表達(dá),并能分泌到細(xì)胞上清。 第四、建立了HIV假病毒中和試驗(yàn)技術(shù)。用HIV慢病毒載體系統(tǒng)的雙質(zhì)粒(包裝質(zhì)粒pSG3deltaEnv、表達(dá)HIV B、C亞型不同株包膜蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1-Env)共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,獲得分別針對(duì)B、C亞型Env的五種假病毒顆粒,分別命名為SVPB6(B亞型)、SVPB12(B亞型)、SVPB13(B亞型)、SVPB8(B亞型)、SVPC5(C亞型)。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示,這五種HIV假病毒能分別被交叉中和單抗2F5、4E10和447-52D所中和。 第五、對(duì)重組痘苗病毒、亞單位疫苗和DNA疫苗單獨(dú)免疫或幾種不同類型的疫苗聯(lián)合免疫的免疫學(xué)特性進(jìn)行了比較研究。小鼠免疫結(jié)果顯示,這四種重組痘苗病毒疫苗和蛋白亞單位疫苗均能誘發(fā)較高水平的HBsAg抗體和相應(yīng)HIV-1交叉中和表位的結(jié)合抗體,蛋白亞單位疫苗誘生的這兩類抗體均明顯高于對(duì)應(yīng)的重組痘苗病毒疫苗。中和抗體檢測(cè)結(jié)果表明,單獨(dú)免疫組中只有三針PS-串聯(lián)表位蛋白亞單位疫苗免疫血清表現(xiàn)出較弱的特異和交叉中和活性,疫苗聯(lián)合免疫組中DNA初免三針蛋白加強(qiáng)一針、痘苗病毒初免兩針蛋白加強(qiáng)一針與蛋白單獨(dú)免疫三針產(chǎn)生的抗體水平相當(dāng),聯(lián)合免疫未進(jìn)一步增強(qiáng)交叉中和抗體水平。 上述結(jié)果表明,HIV中和表位與HBV S抗原融合蛋白多次免疫可以誘發(fā)產(chǎn)生一定程度的HIV交叉中和抗體,而不同類型疫苗聯(lián)合免疫未能進(jìn)一步增強(qiáng)HIV交叉中和抗體反應(yīng)。這些結(jié)果提示,使用相同融合蛋白多次加強(qiáng)免疫更多增強(qiáng)的是融合抗原中載體蛋白的免疫反應(yīng),而不能有效增強(qiáng)融合抗原中HIV這種弱中和表位的免疫反應(yīng);同時(shí)提示,使用不同載體蛋白構(gòu)建的含HIV弱中和表位的融合抗原開展進(jìn)一步提高HIV交叉中和抗原免疫反應(yīng)的研究可能是有價(jià)值的。本研究對(duì)HIV廣譜中和抗體疫苗進(jìn)行了有意義的探索,為深入進(jìn)行這類疫苗的研究提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1642445