本文選題：乙型肝炎病毒　切入點：DNA疫苗　出處：《華中科技大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的 1.構建3種免疫細胞表面分子的胞外段與乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)融合蛋白的真核表達質粒：pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc,并檢測其編碼的融合蛋白在真核細胞中的表達和分泌情況。 2.了解以上構建的3種質粒：pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc以及2個對照質粒：單純表達HBcAg的質粒pHcex和單純表達HBeAg的質粒pHeex電擊免疫誘導小鼠體液免疫應答和細胞免疫應答的情況。 3.了解質粒DNA疫苗pwCTLA-4-HBc和pHcex在小鼠尾靜脈高壓水注射感染性克隆模型上的免疫保護效力。 方法 1.利用分子克隆技術分別構建真核表達質粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc。經酶切鑒定、間接免疫熒光方法、轉染上清和細胞裂解液酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測融合蛋白表達,證實其構建成功。 2.將質粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc、pmCD40L-HBc和對照質粒pHcex和pHeex采用肌肉注射聯合電擊免疫小鼠；采集系列血清間接ELISA有限稀釋法檢測小鼠產生的抗HBV核心抗原的總IgG和IgG2a/IgG1亞型抗體的滴度,了解其體液免疫應答情況和Th1/Th2型細胞免疫應答的情況；3次免疫后4周處死小鼠,用IFN-γ的酶聯免疫斑點實驗(ELISPOT)檢測核心抗原CTL表位肽刺激下產生IFN-γ的小鼠脾臟淋巴細胞的相對數量,了解其特異性CTL細胞免疫應答的情況。 3.選取2種質粒pwCTLA-4-HBc和pHcex同樣方案免疫小鼠,完成免疫周期后2周,尾靜脈高壓水注射pAAV/HBV1.pAAV/HBV 1.2;采集系列血清：ELISA定性檢測小鼠產生HBsAg的情況,了解HBV表達情況；熒光實時定量PCR(realtime PCR)檢測血清中HBV DNA的拷貝數(copy number),了解HBV復制情況。尾靜脈高壓水注射后29和33天分別放血和處死各組的半數小鼠,分離血清間接ELISA有限稀釋法檢測小鼠產生的抗HBV核心抗原和抗HBV表面抗原的總IgG和IgG2a/IgG1亞型抗體的滴度,了解其體液免疫應答情況和Th1/Th2型細胞免疫應答的情況；用IFN-γ的酶聯免疫斑點實驗(ELISPOT)檢測核心抗原和表面抗原CTL表位肽刺激下產生IFN-γ的小鼠脾臟淋巴細胞的相對數量,了解其特異性CTL細胞免疫應答的情況。 結果 1.構建質粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc、pmCD40L-HBc和對照質粒pHcex、pHeex轉染的BHK細胞可檢測到HBc抗原特異性免疫熒光,轉染Hela細胞后細胞裂解液和培養(yǎng)上清中針對HBeAg的ELISA反應強弱不等,但模式與預期吻合。 2.構建質粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc、pmCD40L-HBc和對照質粒pHcex、pHeex免疫小鼠,3次免疫周期結束,小鼠均能產生強弱不等的針對HBV核心抗原的抗體應答,其產生抗體亞型的模式和動力學略有不同,pwCTLA-4-HBc能夠引起Th1/Th2相對平衡的應答,并且在再次加強免疫后能保持這一平衡狀態(tài),而且能夠較快誘導出較強的抗體應答；5種質粒免疫后小鼠脾淋巴細胞經核心抗原CTL表位肽刺激的IFN-γ分泌細胞形成的斑點數顯著多于Mock免疫的對照組,其中pwCTLA-4-HBc和pHcex免疫組顯著多于其它3組。 3.尾靜脈高壓水注射體內轉染pAAV/HBV1.2,經pwCTLA-4-HBc和pHcex免疫的小鼠,能較快清除循環(huán)中的表面抗原,在體內轉染后第5天外周血中的HBV DNA水平較對照組顯著降低。經核心抗原CTL表位肽刺激的IFN-γ分泌細胞形成的斑點數DNA免疫組顯著多于Mock組；針對核心抗原的Th1/Th2型、總IgG抗體反應DNA免疫組比Mock組高；pwCTLA4-HBc免疫組Th2型抗體反應高于pHcex免疫組,但Th1型抗體反應前者低于后者；針對表面抗原的Th1型和總IgG抗體反應：無統計學差異,Th2型抗體反應：2個DNA免疫組都比Mock組抗體滴度高，pwCTLA4-HBc免疫組高于pHcex免疫組。 結論 1.成功構建真核表達質粒pwCTLA-4-HBc、pmCD27-HBc和pmCD40L-HBc。 2.以上構建的3種質粒與對照質粒pHcex和pHeex電擊免疫小鼠,能夠在小鼠體內誘導體液和細胞免疫應答,其中pwCTLA-4-HBc和pHcex的應答最強。 3. pwCTLA-4-HBc和pHcex電擊免疫能夠部分抑制體內轉染的pAAV/HBV1.2在小鼠體內的復制,較快清除抗原,細胞免疫和體液免疫可能都參與了這一過程。
[Abstract]:objective
1., we constructed 3 eukaryotic expression plasmids pwCTLA-4-HBc, pmCD27-HBc and pmCD40L-HBc of the fusion protein of the outer segment of the immune cell surface molecule and the hepatitis B virus core antigen (HBcAg), and detected the expression and secretion of the encoded fusion protein in eukaryotic cells.
2. understand the above 3 plasmids: pwCTLA-4-HBc, pmCD27-HBc and pmCD40L-HBc, as well as 2 control plasmids: plasmid pHcex expressing HBcAg only and plasmid pHeex expressing HBeAg only. The immune response to humoral immune response and cellular immune response in mice is induced by electric shock.
3. the protective effect of plasmid DNA vaccine pwCTLA-4-HBc and pHcex on the infected clone model of mouse tail vein high pressure water injection was studied.
Method
1., molecular cloning technology was used to construct eukaryotic expression plasmid pwCTLA-4-HBc. PmCD27-HBc and pmCD40L-HBc. were identified by enzyme digestion. Indirect immunofluorescence assay was used to detect the fusion protein expression by supernatant and cell lysate enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
2. the plasmid pwCTLA-4-HBc, pmCD27-HBc by intramuscular injection combined with immune shock control mice pmCD40L-HBc and plasmid pHcex and pHeex were collected; anti HBV core antigen and produces a series of indirect ELISA detection method of limited dilution of serum of mice IgG and IgG2a/IgG1 subtype antibody, the solution of the humoral immune response and cellular immune response of Th1/Th2 type the mice were sacrificed; 4 weeks after the 3 immunization, IFN- gamma enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay the relative number of CTL core antigen table generation IFN- gamma peptide stimulated mouse spleen lymphocytes, the solution of the specific CTL cell immune response.
3. selected 2 kinds of plasmid pwCTLA-4-HBc and pHcex the same scheme of immunized mice 2 weeks after immunization period, intravenous injection of pAAV/HBV1.pAAV/HBV 1.2 high pressure water; serial serum: detection of ELISA mice produce qualitatively HBsAg, understand the expression of HBV; real-time fluorescence quantitative PCR (realtime PCR) HBV DNA in serum to detect copy number (copy number), understand the replication of HBV. Tail vein hydrodynamic injection after 29 and 33 days respectively, and half of the mice of each group were sacrificed by bloodletting, titer detection of mice serum separation of indirect ELISA method of limited dilution of anti HBV and anti HBV core antigen surface antigen IgG and IgG2a/IgG1 subtype antibody, the humoral immune responses and Th1/Th2 cell immune response; using IFN- gamma enzyme-linked immunospot (ELISPOT) detection of core antigen and surface antigen CTL IFN- gamma peptide stimulation in mice The relative number of lymphocytes in the spleen to understand the immune response of its specific CTL cells.
Result
1. plasmid pwCTLA-4-HBc, pmCD27-HBc, pmCD40L-HBc and control plasmid pHcex pHeex transfected BHK cells were detected HBc antigen specific immunofluorescence, Hela cells transfected with cell lysates and culture supernatants in response to ELISA or HBeAg range, but the mode and is expected to coincide.
2. plasmid pwCTLA-4-HBc, pmCD27-HBc, pmCD40L-HBc and control plasmid pHcex, pHeex mice after 3 times immunization period, the mice can produce different strength for HBV core antigen antibody response, the antibody subtype pattern and dynamics is slightly different, pwCTLA-4-HBc can cause the relative balance of Th1/Th2 responses, and keep this the equilibrium state after second immunization, and can rapidly induce strong immune responses; the control group were 5 plasmids of immunized mice spleen lymphocytes by IFN- gamma CTL core antigen epitope peptide stimulated the secretion of cell formation was significantly higher than Mock immunity, which pwCTLA-4-HBc and pHcex were significantly more than the other 3 groups.
3. high pressure water injection intravenous in vivo transfection of pAAV/HBV1.2, the pwCTLA-4-HBc and pHcex immunized mice, can quickly remove surface antigen in circulation in vivo, fifth days after transfection of HBV in peripheral blood of DNA was significantly lower than the control group. The number of spots DNA immunized by IFN- gamma CTL core antigen epitope peptide stimulated secretion the cell formation was significantly higher than in group Mock; for Th1/Th2 core antigen, IgG antibody response in DNA immunized group were higher than those of group Mock; pwCTLA4-HBc immune group Th2 antibody was higher than that of pHcex group, but Th1 antibody response to the former than the latter; for Th1 surface antigen and antibody response: Total IgG had no significant difference. Th2 antibody reaction: 2 DNA immune group than the Mock group with high antibody titer, pwCTLA4-HBc immune group was higher than that of pHcex immune group.
conclusion
1. the eukaryotic expression plasmids pwCTLA-4-HBc, pmCD27-HBc and pmCD40L-HBc. were successfully constructed
More than 2. of the 3 plasmids were immunized with the control plasmid pHcex and pHeex, which could induce humoral and cellular immune responses in mice, of which pwCTLA-4-HBc and pHcex had the strongest response.
3., pwCTLA-4-HBc and pHcex can partially inhibit the replication of pAAV/HBV1.2 transfected in vivo, and quickly eliminate antigen, cellular immunity and humoral immunity may be involved in this process.

【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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