本文選題：血管緊張素受體　切入點(diǎn)：自身抗體　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 腎臟移植是臨床根治慢性終末期腎病的有效方法,隨著配型技術(shù)和免疫抑制劑的進(jìn)步,移植后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率降低,短期存活率大幅提高。但是移植后發(fā)生一定比例的急性排斥反應(yīng)(acute rejection, AR)仍然是腎移植術(shù)后的主要并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)(chronic rejection, CR)和移植腎失功的重要危險(xiǎn)因素。同種異體腎移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)主要有兩種機(jī)制,一是抗體介導(dǎo)的體液免疫,二是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫,兩種理論的根本區(qū)別在于移植物的損害是由抗體的活動所造成,還是直接的細(xì)胞毒作用,即由T細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞毒或遲發(fā)性超敏反應(yīng)所造成的。如果受者體內(nèi)存在或出現(xiàn)針對供者特異性的抗體,通常稱為急性體液性排斥反應(yīng)(acute humoral rejection,AHR)或血管性排斥反應(yīng),體液性排斥反應(yīng)導(dǎo)致移植物失功仍是臨床治療中的難題。2001年,第六屆Banff腎移植病理會議正式將同種異型抗體介導(dǎo)的腎移植排斥反應(yīng)的病理診斷補(bǔ)充入Banff國際分型標(biāo)準(zhǔn),急性抗體介導(dǎo)的移植腎排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)包括3個基本特點(diǎn):急性組織損傷的形態(tài)學(xué)證據(jù);抗體作用的免疫病理學(xué)證據(jù)(如腎小管周圍毛細(xì)血管C4d沉積);循環(huán)供體特異性HLA抗體或其他供體內(nèi)皮細(xì)胞抗原特異性抗體的血清學(xué)證據(jù)。Colvin將抗體引起的移植物損傷進(jìn)一步分為四種類型:超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)、慢性排斥反應(yīng)和無臨床癥狀的適應(yīng)狀態(tài)。介導(dǎo)體液性排斥反應(yīng)的抗體多為HLA抗體,我們臨床檢測多可以避免這種排斥反應(yīng),但那些未知抗體目前還沒有引起足夠的重視,雖然發(fā)生幾率不高,但一旦發(fā)生,尚無特異治療手段。因此,鑒別這些非抗HLA抗體并闡明其作用機(jī)制,對體液排斥反應(yīng)的有效治療顯得非常重要。非HLA抗體包括抗MICA抗體、抗MICB抗體、抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體和新近發(fā)現(xiàn)的抗血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(Autoantibodies against the angiotensinⅡtype 1 receptor, AT1-AA)等。AT1-AA于1999年在先兆子癇患者中發(fā)現(xiàn)的,直到2005年Dragun等才發(fā)現(xiàn)在發(fā)生頑固性血管性排斥反應(yīng)的患者中存在AT1-AA,并認(rèn)為AT1-AA在介導(dǎo)血管性排斥反應(yīng)中起重要作用。為證明AT1-AA可引起血管性排斥反應(yīng),Dragun等將含有人AT1-AA的血清注射到腎移植大鼠。實(shí)驗(yàn)使用Fischer344-Lewis腎移植模型,移植后一周,移植腎顯示動脈內(nèi)膜炎和血管內(nèi)浸潤。但該實(shí)驗(yàn)采用人血清,并且不是純化的抗體,不能完全排除存在異種抗原抗體反應(yīng)的可能性,因此,我們認(rèn)為需要采用大鼠源性AT1-AA針對大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),才能更直接闡明AT1-AA對移植腎臟的損傷作用。Dragun等報(bào)道的16例AT1-AA引起的血管性排斥反應(yīng)患者中只有5例C4d陽性,說明其排斥進(jìn)程與HLA抗體介導(dǎo)的血管性排斥反應(yīng)有所區(qū)別。我們推測AT1-AA介導(dǎo)的血管性排斥反應(yīng)機(jī)制并非如HLA抗體那樣結(jié)合細(xì)胞表面抗原后激活補(bǔ)體導(dǎo)致細(xì)胞的損傷,其可能的機(jī)制是與靶細(xì)胞表面的AT1R結(jié)合后啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,促進(jìn)細(xì)胞的增殖或凋亡。為驗(yàn)證以上假設(shè),我們將觀察內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)受到AT1-AA刺激后的功能改變,細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)作為急性排斥反應(yīng)和內(nèi)皮激活的重要指標(biāo)將作為檢測對象。 體液性排斥反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為EC是抗體作用的最初靶點(diǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞在血液和組織液間有廣泛的聯(lián)系和物質(zhì)交換,不僅具有選擇性通透性、抗血栓性、血管緊張調(diào)節(jié)、毛細(xì)血管形成、產(chǎn)生細(xì)胞因子、粘附因子及抗腫瘤活性等功能。細(xì)胞間粘附分子-1是免疫球蛋白超家族中的一員,文獻(xiàn)報(bào)道急性排斥反應(yīng)時,腎小管上皮細(xì)胞和腎血管內(nèi)皮細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)明顯增加,且腎小管上皮細(xì)胞上ICAM-1的表達(dá)與排斥的嚴(yán)重性呈正相關(guān)。ICAM-1不僅是急性排斥反應(yīng)的始動因素,而且在免疫應(yīng)答和移植物的排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。AT1-AA是否會刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖,導(dǎo)致ICAM-1的合成與分泌增加從而加重或啟動血管性排斥反應(yīng)尚無相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將用AT1-AA刺激培養(yǎng)的大鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞,檢測ICAM-1的合成和釋放是否增加。有研究顯示,AngII與AT1R結(jié)合后是通過MAPK、JAK/STAT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能,特別是在內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖和動脈粥樣硬化的形成方面發(fā)揮作用。我們推測AT1-AA可能是通過與這些細(xì)胞表面的配體(AT1R)結(jié)合,轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號。本實(shí)驗(yàn)將研究MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AT1-AA介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能變化中的作用。 對AT1-AA進(jìn)行研究必須獲得一定數(shù)量的AT1-AA,并對其進(jìn)行檢測和鑒定。我們擬用大鼠AT1R多肽免疫大鼠,觀察是否可誘導(dǎo)產(chǎn)生AT1-AA;將AT1-AA注射到腎移植大鼠,觀察是否引發(fā)排斥反應(yīng),探討AT1-AA對腎血管內(nèi)皮細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,然后選用可能的阻斷方法。通過上述研究,闡明同種AT1-AA確可介導(dǎo)早期體液性排斥反應(yīng)、缺血再灌注損傷的移植腎內(nèi)皮細(xì)胞為抗體作用的主要靶點(diǎn)、AT1-AA與受體結(jié)合后的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本課題對于揭示AT1-AA介導(dǎo)體液性排斥反應(yīng)的發(fā)生、作用機(jī)理具有重要意義,為臨床監(jiān)測和治療這一特殊類型排斥反應(yīng)提供理論依據(jù)。 主要研究內(nèi)容: 1.本研究擬用大鼠源性AT1R多肽片段偶聯(lián)血藍(lán)蛋白制備抗原并免疫大鼠,監(jiān)測免疫的大鼠體內(nèi)是否產(chǎn)生AT1-AA,如有AT1-AA生成則對其進(jìn)行分離、純化和鑒定,并觀察其對自身組織有無病理性損傷。 2.采用制備的大鼠源性AT1-AA注射到腎移植受體大鼠,觀察受體大鼠是否發(fā)生急性血管性排斥反應(yīng),并重點(diǎn)觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞有無損傷;給予口服氯沙坦有無保護(hù)作用。 3.在體外實(shí)驗(yàn)中觀察AT1-AA對培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的作用,監(jiān)測內(nèi)皮細(xì)胞受到AT1-AA刺激后ICAM-1的表達(dá)變化。研究AT1-AA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的信號通路,探討AT1-AA介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1變化的分子機(jī)制。使用氯沙坦阻斷對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及ICAM-1合成有無影響,探討氯沙坦是否可作為臨床預(yù)防和治療AT1-AA所致排斥反應(yīng)的措施。 主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果: 1.大鼠源性AT1R多肽偶聯(lián)血藍(lán)蛋白制備免疫原對大鼠進(jìn)行免疫,第二次加強(qiáng)免疫后大鼠血清AT1-AA可疑陽性,第三次加強(qiáng)免疫后AT1-AA血清陽性率90 %,第四次加強(qiáng)免疫后,免疫組AT1-AA陽性率100 %,其中AT1-AA滴度在第13周達(dá)到高峰。使用protein G-sephrose 4B親合層析純化AT1-AA,所得到的抗體進(jìn)行生物學(xué)鑒定,可以使培養(yǎng)的心肌細(xì)胞搏動速度加快。光鏡及電鏡未觀察到明顯的心臟、腎臟和肝臟病理改變。 2.成功建立了大鼠腎移植模型,SD大鼠的MHC個體差異很小,組織相容性很好,移植腎病理改變輕微,術(shù)后第7天活檢按Banff’97在ⅠA以下,腎小管、腎小球、微血管的損害很輕,可作為急性排斥反應(yīng)的對照。 3.腎移植大鼠注射AT1-AA,發(fā)生急性血管性排斥反應(yīng),光鏡下表現(xiàn)為單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤累及微血管,形成動脈內(nèi)膜炎,腎小球毛細(xì)血管炎癥細(xì)胞浸潤,但未見透壁性纖維素樣動脈內(nèi)膜炎;電鏡下顯示內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,破裂形成碎片向管腔內(nèi)突出、脫落,內(nèi)皮細(xì)胞間間隙增寬,連接不完整;血管周圍水腫,管腔內(nèi)炎癥細(xì)胞較多并向管腔外游出。腎移植大鼠注射AT1-AA的同時給予氯沙坦口服具有明顯的保護(hù)作用,移植腎功能得到保護(hù),移植腎損傷明顯減輕。 4.采用組織塊移植法進(jìn)行大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng),并對培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行純化和傳代培養(yǎng),經(jīng)免疫熒光測定,其標(biāo)志物vWF表達(dá)陽性,純度高,可滿足實(shí)驗(yàn)需求。 5.用不同濃度的AT1-AA(1:200,1:100,1:50)刺激內(nèi)皮細(xì)胞,在刺激后不同時間分別檢測ICAM-1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AT1-AA作用后,ICAM-1水平在0-24h內(nèi)隨作用時間的延長逐漸升高,至24h時,ICAM-1水平達(dá)到最高,36h開始下降。不同濃度的AT1-AA所導(dǎo)致的ICAM-1水平升高程度有所不同,濃度越高,對內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)合成ICAM-1的影響越大,其中以稀釋度為1:50的AT1-AA對其影響最大。 6.使用制備的AT1-AA刺激培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞,在不同的時間點(diǎn)檢測ERK1/2、p38MAPK和JNK/SAPK的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),AT1-AA能夠激活ERK1/2和p38MAPK,在20分鐘左右活化作用最強(qiáng),隨著時間的延長,ERK1/2、p38MAPK水平逐漸下降;AT1-AA對JNK/SAPK無明顯活化作用。 7.使用不同濃度的PD98059(30μM、60μM)和氯沙坦(10-6mol/L、10-5mol/L)可明顯抑制ERK1/2活性,其中60μM PD98059和10-5mol/L氯沙坦對ERK的抑制最為顯著。在p38MAPK通路的實(shí)驗(yàn)中顯示不同濃度的SB203580(20μM、40μM)和氯沙坦(10-6mol/L、10-5mol/L)也在不同程度上抑制p38MAPK的激活,其中40μM SB203580和10-5mol/L氯沙坦效果較為明顯。 8.分別使用SB203580、PD98059和氯沙坦對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,在加入AT1-AA后24h收集內(nèi)皮細(xì)胞檢測ICAM-1的合成情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯沙坦和SB203580聯(lián)合對內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)處理對ICAM-1的升高抑制最為顯著,可以抑制約97%,單獨(dú)加入PD98059或單獨(dú)加入氯沙坦對AT1-AA引起的ICAM-1升高的抑制相對較低,分別為40%和55%。 結(jié)論: 1.大鼠源性AT1R多肽能夠誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生AT1R自身抗體,此抗體對自身組織的損傷作用不明顯。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠源性AT1-AA的存在,并成功的對抗體進(jìn)行分離、純化,為進(jìn)一步研究其在器官移植中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2.采用制備的大鼠源性AT1-AA注射到腎移植受體大鼠,觀察發(fā)現(xiàn)受體大鼠發(fā)生急性血管性排斥反應(yīng),光鏡和電鏡顯示移植腎血管內(nèi)皮細(xì)胞有明顯損傷。 3. AT1-AA可引起部分難治性血管性排斥反應(yīng),推測其可能機(jī)制是與內(nèi)皮細(xì)胞表面AT1R結(jié)合后啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,造成內(nèi)皮功能紊亂,表現(xiàn)之一是合成并分泌ICAM-1,進(jìn)而導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤并進(jìn)一步破壞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致移植物失功。使用AT1R阻斷劑(如氯沙坦)可以減輕這種排斥反應(yīng),對移植腎有益,提示臨床移植前后需要檢測受體AT1-AA水平,特別是既往妊高癥或惡性高血壓患者,治療AT1-AA引起的排斥反應(yīng)可以早期使用ARBs。 4.用AT1-AA刺激培養(yǎng)的大鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞,可以誘導(dǎo)ICAM-1的合成和釋放增加,AT1-AA可以活化ERK1/2、p38MAPK,使用ERK1/2通路阻斷劑PD98059、p38MAPK通路阻斷劑SB203580和氯沙坦能抑制ICAM-1的合成。提示我們預(yù)防和治療AT1-AA介導(dǎo)排斥反應(yīng)的手段可以考慮使用ARBs、ERK/p38MAPK通路阻斷劑以及ICAM-1與LFA-1結(jié)合位點(diǎn)阻斷,其作用點(diǎn)各不相同,我們把它們分別稱為受體結(jié)合階段、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)階段和效應(yīng)分子階段,為將來AT1-AA的治療提供重要理論參考。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R699.2;R392.4

【引證文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 顏耀華;子癇前期差異表達(dá)基因LAIR-2對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

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本文編號：1633061