本文選題：ASPP家族　切入點(diǎn)：iASPPsv　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的:iASPP是p53凋亡促進(jìn)蛋白家族(apoptosis stimulating protein of p53, ASPP)的抑制性成員(inhibitory member of ASPP of p53family, iASPP),能夠特異性抑制p53的促凋亡活性。iASPPsv是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的iASPP短型剪接體,全長(zhǎng)407氨基酸,和828氨基酸的iASPP在C端高度同源。研究顯示iASPPsv能夠抑制p53蛋白對(duì)Bax基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)iASPPsv的人類乳腺癌細(xì)胞株,研究了iASPPsv高表達(dá)細(xì)胞生物學(xué)功能及對(duì)化療藥物敏感性的改變。 研究方法：構(gòu)建慢病毒載體pCDH-iASPPsv,感染人類乳腺癌細(xì)胞系MCF7,經(jīng)有限稀釋法篩選得到表達(dá)iASPPsv的MCF7單克隆和感染pCDH的MCF7單克隆。經(jīng)VP-16處理后,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平,用Real time PCR檢測(cè)凋亡基因Bax、PUMA、Noxa的mRNA表達(dá)水平,Western blot方法檢測(cè)組蛋白H2AX的水平。 結(jié)果：(1)經(jīng)慢病毒感染和有限稀釋法篩選后,得到3個(gè)表達(dá)iASPPsv的MCF7單克隆,經(jīng)Western blot檢測(cè),證實(shí)其iASPPsv的蛋白表達(dá)水平高于感染pCDH的MCF7。(2)對(duì)iASPPsv在化療藥物VP-16抑制細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞經(jīng)不同濃度VP-16處理24h、48h后,表達(dá)iASPPsv的MCF7的生長(zhǎng)抑制率顯著低于感染pCDH的MCF7。(3)對(duì)iASPPsv在化療藥物VP-16誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)200μg/mL VP-16處理24h、48h后,表達(dá)iASPPsv的MCF7的凋亡水平顯著低于感染pCDH的MCF7。(4)進(jìn)一步對(duì)其分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)200μg/mLVP-16處理24h、48h后,表達(dá)iASPPsv的MCF7中凋亡基因Bax、PUMA和Noxa的mRNA水平顯著低于感染pCDH的MCF7。(5)為確定iASPPsv對(duì)于藥物處理后的細(xì)胞中DNA損傷水平的影響,進(jìn)一步檢測(cè)藥物處理后H2AX的水平,結(jié)果顯示經(jīng)200μg/mL VP-16處理24h后,表達(dá)iASPPsv的MCF7中H2AX水平高于感染pCDH的MCF7。 結(jié)論：iASPPsv能夠抵抗VP-16對(duì)MCF7的生長(zhǎng)抑制作用,抑制促凋亡基因Bax、 PUMA、Noxa的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡。iASPPsv可能通過(guò)抑制p53相關(guān)的凋亡途徑降低了細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,但細(xì)胞中的DNA雙鏈斷裂損傷仍然存在并累積,從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。 研究目的：iASPP是p53結(jié)合蛋白ASPP家族中的一員,能夠抑制p53對(duì)促凋亡蛋白轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄作用,從而抑制p53誘導(dǎo)的凋亡的水平。我們已證實(shí)iASPsv能夠減弱VP-16對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF7產(chǎn)生的增殖抑制作用,能夠減弱經(jīng)VP-16處理后MCF7中促凋亡基因Bax、PUMA和Noxa的表達(dá)水平,進(jìn)而減弱細(xì)胞的凋亡水平,但同時(shí),使細(xì)胞中H2AX蛋白的水平升高,顯示了細(xì)胞中存在更多的DNA雙鏈損傷。為了進(jìn)一步研究iASPP/iASPPsv在正常細(xì)胞中的作用,我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了iASPP/iASPPsv轉(zhuǎn)基因小鼠。我們用Dex或VP-16處理iASPP/iASPPsv轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞,研究iASPP/iASPPsv拮抗化療藥物誘導(dǎo)凋亡的作用。 研究方法：取野生C57小鼠和iASPP轉(zhuǎn)基因小鼠的胸腺,經(jīng)小鼠淋巴液分離得到小鼠胸腺細(xì)胞。經(jīng)VP-16或Dex處理后,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平,用Westrn blot檢測(cè)組蛋白H2AX的水平。 結(jié)果：(1)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)野生C57小鼠胸腺細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞的表面抗原,結(jié)果顯示,二者的分化程度沒(méi)有顯著不同,說(shuō)明后續(xù)實(shí)驗(yàn)顯示出的差異不是由于細(xì)胞分化程度不同引起的；(2)細(xì)胞經(jīng)不同濃度VP-16或Dex處理48h后,轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率低于野生C57小鼠的；(3)經(jīng)VP-16或Dex處理12h、24h、48h,轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡程度低于野生C57小鼠的；(4)經(jīng)0.1μg/mlVP-16或者1nM Dex處理48h后,轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞的H2AX含量高于野生C57小鼠胸腺細(xì)胞的H2AX水平。 結(jié)論：iASPP能夠抵抗Dex或VP-16對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制；iASPP能夠抑制Dex或VP-16處理后小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡水平；iASPP的存在導(dǎo)致細(xì)胞群體中DNA損傷細(xì)胞的比例增加。
[Abstract]:Objective: iASPP is p53 apoptosis protein family (apoptosis stimulating protein of p53, ASPP) inhibitory member (inhibitory member of ASPP of p53family, iASPP), which can promote the apoptosis activity of.IASPPsv specific inhibitor of the p53 is iASPP short type spliceosome discovered by our laboratory, a total length of 407 amino acids and 828 amino acids iASPP at the C end. Research shows that iASPPsv is highly homologous to the transcription of Bax gene promoter p53 protein. We constructed the stable expression of iASPPsv in human breast cancer cell line, on the high expression of iASPPsv cell biology function and sensitivity to chemotherapy drugs.
Research methods: to construct the lentiviral vector pCDH-iASPPsv infection of human breast cancer cell lines MCF7, iASPPsv and MCF7 expression of monoclonal MCF7 monoclonal pCDH infection by limited dilution screening. After VP-16 treatment, with the inhibition rate of MTT cells detected by growth, apoptosis cells were detected by flow cytometry, for the detection of apoptosis the Real time PCR gene Bax, PUMA, Noxa expression level of mRNA Western blot method to detect the level of histone H2AX.
Results: (1) screened by lentivirus infection and limited dilution method, 3 expression of iASPPsv MCF7 by Western blot assay, clone, expression level of iASPPsv protein was higher than that of the confirmed pCDH infection in MCF7. (2) on iASPPsv cell growth inhibition by the study found that in the chemotherapy of VP-16, cells were treated with 24h and treated with different concentrations of VP-16 after 48h, the expression of iASPPsv MCF7 growth inhibition rate of pCDH infection was significantly lower than that of MCF7. (3) found on the apoptosis of iASPPsv in chemotherapy induced by 200 g/mL VP-16, VP-16 24h, 48h, apoptosis, the expression level of iASPPsv MCF7 was significantly lower than that of pCDH infection MCF7. (4) further study on the molecular mechanism of the discovery, by 200 g/mLVP-16 24h, 48h iASPPsv MCF7, the expression of apoptosis gene Bax, PUMA and Noxa mRNA levels were significantly lower than those infected with pCDH MCF7. (5) to determine the drug for iASPPsv The effect of DNA damage level in the treated cells further detected the level of H2AX after drug treatment. The results showed that after 200 g/mL VP-16 treatment of 24h, the H2AX level of MCF7 expressing iASPPsv was higher than that of infected pCDH.
Conclusion: iASPPsv can resist VP-16 MCF7 on growth inhibition, inhibition of apoptosis gene Bax, PUMA, Noxa transcription and apoptosis of.IASPPsv cells via apoptosis correlated with inhibition of p53 reduces the sensitivity of cells to chemotherapeutic drugs, but the cells in DNA double strand break damage still exists and accumulated, leading to malignant tumor the occurrence.
Objective: iASPP is a member of the p53 binding protein of the ASPP family, p53 can inhibit the transcription of the pro apoptotic protein transcripts, thereby inhibiting the apoptosis induced by p53 level. We have confirmed that iASPsv can weaken the inhibitory effect of VP-16 on breast cancer cell line MCF7 proliferation can be reduced after treatment with VP-16 in MCF7 the pro apoptotic gene Bax expression levels of PUMA and Noxa, and then decreased levels of apoptosis cells, but at the same time, increased H2AX protein levels in the cells, showing double strand damage more DNA cells. In order to further study the iASPP/ iASPPsv role in normal cells, our laboratory constructed iASPP/iASPPsv transgenic mice. Using Dex or VP-16 iASPP/iASPPsv transgenic mice thymus cells of iASPP/iASPPsv antagonize apoptosis induced by chemotherapy drugs.
Methods: the thymus take wild C57 mice and iASPP transgenic mice, the mice thymocytes obtained lymph separation. After VP-16 or Dex treatment, the rate of inhibition by MTT method to detect cell growth, apoptosis cells were detected by flow cytometry, Westrn blot protein was detected by H2AX.
Results: (1) the surface antigen detection of wild C57 mouse thymus cells and transgenic mice thymus cells by flow cytometry showed that the differentiation degree of the two did not differ significantly, indicating differences in subsequent experiments showed that is not due to cell differentiation caused by different; (2) cells were treated with different concentrations of VP-16 or Dex 48h, transgenic mice thymus cell growth inhibition rate than the wild C57 mice; (3) after VP-16 or Dex treatment 12h, 24h, 48h, the degree of apoptosis in transgenic mice thymocytes than the wild C57 mice; (4) by 0.1 g/mlVP-16 or 1nM Dex after 48h treatment, H2AX content of transgenic mouse thymus cells the C57 is higher than that of wild mouse thymus cells H2AX level.
Conclusion: iASPP can resist the growth inhibition of Dex or VP-16 on mouse thymocytes. IASPP can inhibit thymocyte apoptosis level after Dex or VP-16 treatment, and the presence of iASPP causes the proportion of DNA damage cells in cell population.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1632104