本文選題：人類(lèi)胚胎干細(xì)胞　切入點(diǎn)：核型　出處：《廣州醫(yī)學(xué)院》2009年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)因具有自我更新并分化成為三個(gè)胚層不同類(lèi)型細(xì)胞的潛能,在再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞替代治療中具有重要的作用。體外培養(yǎng)過(guò)程中遺傳和表觀遺傳的穩(wěn)定是評(píng)價(jià)hESC治療前景的重要條件。盡管對(duì)hESC分化過(guò)程中的遺傳改變已有所了解,但對(duì)其表觀遺傳變化卻依然知之甚少。本研究利用表觀遺傳修飾的一個(gè)重要組成部分--X染色體失活(XCI)及印跡、甲基化現(xiàn)象,通過(guò)甲基化特異性PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光染色等方法,對(duì)hESC的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步研究,對(duì)其XCI、相關(guān)印跡基因和部分X連鎖基因的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行了分析。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室建立的六株女性hESC的研究表明,和小鼠胚胎干細(xì)胞XCI狀態(tài)不一樣,hESC在未分化階段就已出現(xiàn)了X染色體失活。正常二倍體hESC在分化后能穩(wěn)定的保持XCI狀態(tài)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn),五株雜合子hESC的XCI具有兩種不同的狀態(tài):四株hESC具有極度傾斜性XCI狀態(tài),一株hESC的XCI卻是隨機(jī)的。有意思的是,對(duì)三倍體hESC (核型69,XXX)的研究發(fā)現(xiàn),這種細(xì)胞具有兩條活性X染色體,其XCI狀態(tài)隨著體外的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)發(fā)生了變化。對(duì)印跡基因及X連鎖基因的研究表明,hESC能維持正常的表達(dá)狀態(tài)。本研究還對(duì)一株人類(lèi)孤雌胚胎干細(xì)胞(hpESC)的以上特性進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞具有遺傳和表觀遺傳的不穩(wěn)定性。本研究表明,在安全應(yīng)用hESC于再生醫(yī)學(xué)前,必須進(jìn)行更深入的表觀機(jī)制及細(xì)胞功能分析。 第一部分 人類(lèi)受精卵來(lái)源胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及其生物學(xué)特征鑒定 【研究目的】 對(duì)前期利用廢棄的低質(zhì)量胚胎建立的hESC系進(jìn)行培養(yǎng),為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。對(duì)所建立hESC系進(jìn)行干細(xì)胞特性鑒定,掌握不同細(xì)胞系的生物學(xué)特性。 【材料方法】 1、利用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的hESC系,體外培養(yǎng)傳代。進(jìn)行hESC表面抗原SSEA-1,SSEA-4, TRA-1-60,TRA-1-81等染色鑒定。 2、每隔10代進(jìn)行一次染色體核型鑒定,每次計(jì)數(shù)20個(gè)分裂像。 3、體外培養(yǎng)保持未分化狀態(tài),收集不同代次間的細(xì)胞,提取基因組DNA和總RNA。 4、對(duì)以上細(xì)胞體外進(jìn)行自體分化,分別收集分化第零天及第三、七和第二十天的細(xì)胞,提取基因組DNA和總RNA。 5、RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)經(jīng)典的Ⅰ類(lèi)未分化分子標(biāo)記物基因的表達(dá)情況。 6、體內(nèi)外分化能力檢測(cè):懸浮培養(yǎng)hESC細(xì)胞,形成擬胚體,進(jìn)行分化標(biāo)記物基因RT-PCR檢測(cè);將hESC團(tuán)塊接種到SCID小鼠的腹股溝皮下,觀察是否有腫瘤生長(zhǎng)。 7、對(duì)各株hESC細(xì)胞進(jìn)行16個(gè)STR位點(diǎn)鑒別。 【結(jié)果】 1、核型分析,四株hESC為正常核型:46, XX (FY-hES-7,-8,-10,-11);一株為平衡易位13三體核型(FY-hES-5):46, XX,+13,der(13;13) (q10;q10);一株為三倍體細(xì)胞(FY-3PN):69,XXX。 2、六株hESC系均具有典型的hESC克隆形態(tài),表達(dá)hESC細(xì)胞表面抗原SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81;不表達(dá)SSEA-1。 3、經(jīng)典的Ⅰ類(lèi)未分化分子標(biāo)記物基因OCT4,NANOG,TDGF1,SOX 2,EBAF, THY-1,FGF4,REX-1等在六株hESC系中均表達(dá)陽(yáng)性。 4、六株hESC系均具有體外自發(fā)分化形成囊性擬胚體的能力,分化標(biāo)記物基因AFP,NEUROD1,HBZ等表達(dá)陽(yáng)性。六株hESC均能形成畸胎瘤。 5、每株hESC系的STR圖譜都不一樣,證明其來(lái)自于不同的胚胎。 【結(jié)論】 1、采用本實(shí)驗(yàn)室最佳培養(yǎng)體系,確保各細(xì)胞具有相同的培養(yǎng)條件,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞資源。 2、六株hESC系在體外長(zhǎng)期傳代中,能夠維持hESC細(xì)胞的生物學(xué)特性,具有自我更新、分化的能力。 3、STR位點(diǎn)分析用于hESC系的鑒定,可以為其提供相應(yīng)的“身份證”,區(qū)分不同的細(xì)胞株,為干細(xì)胞將來(lái)的臨床應(yīng)用建立完善的檔案資料。 4、利用廢胚的胚胎進(jìn)行hESC細(xì)胞的建系,可能導(dǎo)致異常核型干細(xì)胞的產(chǎn)生。核型分析證實(shí)羅伯遜易位和三倍體的hESC在體外培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生自我修復(fù)的現(xiàn)象,能保持遺傳性質(zhì)的穩(wěn)定。 第二部分 人類(lèi)胚胎干細(xì)胞X染色體失活及印跡、X連鎖基因表達(dá)狀態(tài)第一章正常與異常核型人類(lèi)胚胎干細(xì)胞X染色體失活狀態(tài)分析 【研究目的】 以XCI為重點(diǎn),對(duì)正常與異常核型人類(lèi)受精卵來(lái)源hESC在自我更新與分化過(guò)程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,初步了解正常與異常核型hESC在體外培養(yǎng)過(guò)程中的XCI狀態(tài),并探討異常核型hESC的XCI狀態(tài)與正常核型hESC的異同。 【材料方法】 1、對(duì)各細(xì)胞DNA進(jìn)行人雄激素受體基因(HUMARA)多態(tài)性片斷分析,判斷其純合性,選擇HUMARA基因雜合子進(jìn)行XCI傾斜性分析。 2、使用EpiTect Bisulfite Kit試劑盒(QIGEN),將基因組DNA進(jìn)行用重亞硫酸鹽處理,隨后行引物特異性PCR反應(yīng),并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多態(tài)性片段分析。 3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)XCI相關(guān)基因XIST在不同時(shí)期的表達(dá)情況。 4、細(xì)胞低密度種于四孔板內(nèi),保持未分化狀態(tài),行組蛋白H3賴氨酸27三甲基化(H3K27me3)免疫熒光染色(Cell Signaling, USA)。 【結(jié)果】 1、正常核型細(xì)胞中,三株細(xì)胞HUMARA位點(diǎn)為雜合子,一株細(xì)胞為純合子。二株異常核型的女性hESC的HUMARA位點(diǎn)也為雜合子。三倍體細(xì)胞HUMARA位點(diǎn)表現(xiàn)出三個(gè)不同的位點(diǎn)。 2、對(duì)六株hESC的XCI失活分析表明,所有細(xì)胞在未分化階段均已開(kāi)始啟動(dòng)XCI。 3、對(duì)五株HUMARA位點(diǎn)雜合子的hESC進(jìn)行XCI傾斜性失活分析,四株細(xì)胞具有極度傾斜性失活狀態(tài),一株細(xì)胞表現(xiàn)為隨機(jī)失活狀態(tài)。失活狀態(tài)在細(xì)胞分化后可以穩(wěn)定的維持。三倍體細(xì)胞具有兩條活性X染色體,失活狀態(tài)在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生了變化,從隨機(jī)失活逐漸變?yōu)闃O度傾斜性X失活。 4、XIST基因伴隨XCI的出現(xiàn)在未分化階段已可檢出。在不同的分化時(shí)期,不同的細(xì)胞系有不同的XIST基因的表達(dá)情況。 5、組蛋白H3K27三甲基化免疫熒光染色證實(shí)未分化狀態(tài)細(xì)胞的確啟動(dòng)了XCI。 【結(jié)論】 1、基于HUMARA的甲基化特異性PCR是研究hESC傾斜性XCI的一個(gè)好方法。 2、hESC的XCI具有兩種不同的類(lèi)型:一種為極度傾斜性失活,一種為隨機(jī)失活。 3、和小鼠胚胎干細(xì)胞不同,hESC在未分化階段就已開(kāi)始啟動(dòng)XCI。正常核型二倍體hESC的傾斜性或隨機(jī)XCI可以在細(xì)胞傳代、分化過(guò)程中保持穩(wěn)定。 4、分化前后XIST基因表達(dá)的變化表明不同的hESC表達(dá)XCI標(biāo)記的能力不一致。大部分細(xì)胞系在分化前啟動(dòng)了XCI,但在分化過(guò)程中逐漸完成XCI。 5、H3K27me3表達(dá)證實(shí)未分化細(xì)胞的確進(jìn)行了XCI。 6、異常核型hESC具有和正常hESC相似的XCI狀態(tài),在未分化階段已啟動(dòng)XCI。 7、體外培養(yǎng)條件也許能影響三倍體hESC的XCI穩(wěn)定性,導(dǎo)致傾斜性XCI的發(fā)生。 8、三倍體細(xì)胞因?yàn)榫哂腥龡lX染色體,在進(jìn)行X失活時(shí),由于只有一條傾斜性失活,而另兩條則全為活性,這將導(dǎo)致其比正常細(xì)胞多一倍的基因表達(dá)活性,這可能是三倍體胚胎容易流產(chǎn)的一個(gè)表觀遺傳學(xué)原因。 第二章人類(lèi)胚胎干細(xì)胞印跡基因及X連鎖基因表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)研究 【研究目的】 對(duì)具有傾斜性XCI的hESC的X連鎖基因PGK1、X染色體上抑癌基因及癌癥基因和常染色體印跡基因的表達(dá)情況分析,研究這些基因是否隨著X染色體的傾斜性失活而發(fā)生變化。檢測(cè)X染色體及常染色體上重要基因的啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)隨著細(xì)胞分化是否產(chǎn)生改變。 【材料方法】 1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)X連鎖基因PGK1、X染色體上抑癌基因RBBP7及癌癥基因GPC4在不同時(shí)期的表達(dá)情況。 2、選取常染色體上父系印跡基因H19、IGF2R,母系印跡基因SNRPN進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),比較不同時(shí)期、不同核型對(duì)印跡基因的影響情況。 3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常和異常核型hESC體外自體分化過(guò)程中,多能性調(diào)控基因OCT4、NANOG的表達(dá)情況。 4、將不同細(xì)胞不同時(shí)期的基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理,隨后行引物特異性PCR反應(yīng)。凝膠電泳分析產(chǎn)物。 【結(jié)果】 1、正常和異常核型hESC的PGK1基因隨著分化時(shí)間的增加呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)。 2、異常核型hESC抑癌基因RBBP7及癌癥基因GPC4隨著分化時(shí)間的增加呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì),而在正常核型hESC中則下調(diào)。 3、正常和異常核型hESC中印跡基因表達(dá)基本一致:父系印跡基因H19、IGF2R上調(diào)而母系印跡基因SNRPN表達(dá)則下調(diào)。 4、正常核型hESC隨著分化時(shí)間的增加,多能性調(diào)控基因OCT4、NANOG表達(dá)明顯下降,而異常核型hESC中OCT4、NANOG則下降相對(duì)沒(méi)有正常細(xì)胞顯著。 5、正常和異常核型胚胎干細(xì)胞XIST基因、SNRPN基因在未分化狀態(tài)可檢出甲基化和未甲基化兩種狀態(tài),并能在體外分化過(guò)程中保持穩(wěn)定。 【結(jié)論】 1、X連鎖基因PGK1、印跡基因在正常和異常核型hESC中表達(dá)基本一致,證明檢測(cè)基因在hESC的發(fā)育過(guò)程中能維持正常調(diào)節(jié)。 2、正常和異常核型干細(xì)胞XIST基因、SNRPN基因啟動(dòng)子區(qū)域有正常的DNA甲基化狀態(tài),并能隨著細(xì)胞分化維持穩(wěn)定的甲基化狀態(tài)。 3、異常核型hESC抑癌基因、癌癥基因表達(dá)相對(duì)正常核型hESC的增加表明此種細(xì)胞具有更危險(xiǎn)的應(yīng)用前景,同時(shí)多能性基因在分化后仍能檢出表明此種細(xì)胞分化能力較正常細(xì)胞弱。 第三部分 孤雌人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的遺傳和表觀遺傳穩(wěn)定性初步研究 【研究目的】 1、培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室建立的一株人孤雌胚胎干細(xì)胞(hpESC) ,并在其培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行核型分析,了解這種細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性。 2、對(duì)父系基因缺乏的hpESC的XCI狀態(tài)、印跡基因、多能性調(diào)控基因表達(dá)情況進(jìn)行研究,了解其表觀遺傳學(xué)特性及相關(guān)生物學(xué)特性。 【材料方法】 1、體外培養(yǎng)hpESC,與捐卵者DNA比較,檢測(cè)其STR、HLA,證實(shí)其孤雌來(lái)源。 2、每10代進(jìn)行一次核型分析,每次計(jì)數(shù)20個(gè)分裂像。 3、提取孤雌細(xì)胞DNA進(jìn)行HUMARA多態(tài)性片斷分析。 4、將基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理并行引物特異性PCR反應(yīng)。 5、選取常染色體上父系印跡基因H19,母系印跡基因SNRPN、IGF2進(jìn)行PCR檢測(cè)。 6、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)hpESC體外自體分化中多能性調(diào)控基因OCT4的表達(dá)。 【結(jié)果】 1、與志愿捐卵者DNA比較,其STR、HLA均為純合子,與志愿者DNA半匹配,證實(shí)其的確是孤雌細(xì)胞。 2、核型的不穩(wěn)定:在第20代核型為46,XX,第30-50代為46,XX/45,X嵌合體,到了第60代后又恢復(fù)為46,XX核型。 3、HUMARA基因多態(tài)性分析表明,hpESC此基因位點(diǎn)為純合子。 4、對(duì)hpESC進(jìn)行XCI分析,其在第20代沒(méi)有檢出失活的X染色體,表明其為雙活性X染色體。到了第60代后,其進(jìn)行了XCI,一條X為活性的,另一條X為失活的,但由于其為純合子,不能分析其是否具有傾斜性失活狀態(tài)。 5、XIST基因在早期不表達(dá)。長(zhǎng)期培養(yǎng)后,伴隨XCI的發(fā)生,XIST基因表達(dá)可檢出。 6、hpESC母系印跡基因SNRPN、IGF2沒(méi)有表達(dá)。 7、多能性調(diào)控基因OCT4在hpESC分化后仍可檢出,與其分化能力弱有一定聯(lián)系。 【結(jié)論】 1、本實(shí)驗(yàn)室建立的珍貴細(xì)胞的確是人孤雌胚胎干細(xì)胞。 2、純合子hpESC在體外培養(yǎng)中其遺傳學(xué)特性不穩(wěn)定。 3、X失活研究表明,hpESC早期是雙活性,這可能是其X染色體不穩(wěn)定的原因之一。在培養(yǎng)過(guò)程中,其X染色體進(jìn)行了選擇和修復(fù),并最終發(fā)生了XCI。
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【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐世永,劉紅林;哺乳動(dòng)物X染色體失活機(jī)制[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2004年04期

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本文編號(hào)：1615407