本文選題：表皮干細(xì)胞　切入點(diǎn)：不同發(fā)育階段　出處：《南昌大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:利用基因芯片技術(shù)篩選不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞差異表達(dá)基因,分析不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞基因表達(dá)變化的特征及其可能的生物學(xué)意義,為進(jìn)一步探討表皮干細(xì)胞增殖分化調(diào)控機(jī)制提供新思路和線索。 方法:收集28～32周胎兒,4～12周歲少兒、35～55歲成年人3組正常人皮膚標(biāo)本,采用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮,Ⅳ型膠原快速粘附法分離、純化人表皮干細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別行β1整合素、K19單抗檢測鑒定。將21522條Oligo DNA用點(diǎn)樣儀點(diǎn)制在一張經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上制備成表達(dá)譜芯片。按Trizol一步法分別提取各組細(xì)胞總RNA ,瓊脂糖甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。通過逆轉(zhuǎn)錄方法將Cy3熒光標(biāo)記到Human對(duì)照組DNA上(以人類基因作為共同參照),將Cy5熒光標(biāo)記到實(shí)驗(yàn)組(胎兒組、少兒組與成人組)cDNA上,制成探針,并與表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交及掃描芯片熒光信號(hào)圖像。采用LuxScan 3.0圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析,把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào),以2倍差異表達(dá)值(Ratio)篩選差異表達(dá)基因。選擇明顯上調(diào)或抑制的基因,用Real time RT-PCR技術(shù)對(duì)相關(guān)的基因作進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果:基因芯片高通量地揭示了胎兒、少兒和成人組表皮干細(xì)胞的遺傳信息。成人組與少兒組樣本相比,差異表達(dá)基因有1808條,其中上調(diào)的基因有1089條,下調(diào)的基因有719條;已知基因1462條(已在Gene Bank登錄),未知基因346條。少兒與胎兒組樣本相比,差異表達(dá)基因有4534條,其中上調(diào)的基因有1783條,下調(diào)的基因有2751條;已知基因3577條(已在Gene Bank登錄),未知基因957條。對(duì)篩選出的成人與少兒,少兒與胎兒的差異表達(dá)基因結(jié)果在Molecu- le Annotation System進(jìn)行了Go分類的統(tǒng)計(jì)分析,根據(jù)基因功能分類,成人與少兒差異表達(dá)基因可分為128類,少兒與胎兒差異表達(dá)基因可分為216類,因一個(gè)基因可以有多個(gè)功能,其總數(shù)大于篩選出的差異基因總和。其中1104條基因在胎兒、少兒與成人組樣本中呈持續(xù)差異表達(dá),根據(jù)基因功能分為32類。差異基因涉及蛋白質(zhì)翻譯、能量合成和DNA復(fù)制,均與表皮干細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)檢測到持續(xù)差異表達(dá)基因中有94條基因表達(dá)差異呈持續(xù)上調(diào),75條表達(dá)差異呈持續(xù)下調(diào)。表達(dá)持續(xù)上調(diào)的基因類別主要為核苷酸結(jié)合蛋白基因(如NM_005381、NM_024045)、蛋白質(zhì)折疊結(jié)合相關(guān)基因(如NM_002157、NM_006260)、鋅離子結(jié)合蛋白基因和ATP結(jié)合蛋白基因等。表達(dá)持續(xù)下調(diào)的基因類別主要為GTP結(jié)合蛋白基因、序列特異性DNA結(jié)合蛋白基因(如NM_005253、NM_001421)、促分裂原活化蛋白激酶基因(如NM_002746、NM_002754)、核仁蛋白家族基因和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白基因等。Real time RT-PCR結(jié)果顯示胎兒、少兒與成人樣本中TUBGCP3表達(dá)量持續(xù)增高,而FOSL2的表達(dá)量持續(xù)降低,與芯片篩選結(jié)果相一致,說明本次基因芯片篩查結(jié)果真實(shí)、可靠。 結(jié)論:體外培養(yǎng)的胎兒、少兒與成人表皮干細(xì)胞基因表達(dá)譜有明顯不同,伴隨人體生長發(fā)育,成人相對(duì)于少兒、少兒相對(duì)于胎兒表皮干細(xì)胞,一些與細(xì)胞成熟相關(guān)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白基因上調(diào),而如GTP結(jié)合蛋白基因、序列特異性DNA結(jié)合蛋白基因和MAKP活性蛋白基因等一些與細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因下調(diào)。提示隨著年齡的增長,表皮干細(xì)胞在維持細(xì)胞形態(tài)和保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)特性以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持上更加成熟,而其增殖分化的能力可能呈現(xiàn)下降趨勢。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1611284