本文選題：丙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：核心蛋白　出處：《中南大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:2′-5′寡腺苷酸合成酶(2′-5′Oligoadenylate synthetase,OAS)啟動(dòng)子基因克隆及OAS啟動(dòng)子-pGL3-Basic載體構(gòu)建,探討OAS啟動(dòng)子在丙型肝炎特異性基因治療中的應(yīng)用。 方法:①以報(bào)道的OAS基因啟動(dòng)子序列(-159到+82)為母板,設(shè)計(jì)兩端含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HindⅢ和SacⅠ的引物。以健康獻(xiàn)血員基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。②將分離純化的PCR產(chǎn)物用T4 DNA連接酶與pGL3-Basic載體相連,轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)大腸桿茵,篩選陽性克隆,進(jìn)行HindⅢ和SacⅠ雙酶切鑒定并測(cè)序。③將pcDNA3.1(-)/core重組真核表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人胚胎肝細(xì)胞L02中,用RT-PCR和Western blot免疫印跡法檢測(cè)丙型肝炎病毒核心蛋白的表達(dá)。④將OAS Promoter-pGL3-Basic vector瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入表達(dá)丙型肝炎病毒核心蛋白的L02細(xì)胞中,72h后檢測(cè)熒光素酶的活性。 結(jié)果:①酶切及測(cè)序證實(shí)成功克隆2'-5'OAS啟動(dòng)子基因,與GeneBank中2'-5'OAS啟動(dòng)子序列一致。②經(jīng)測(cè)序、限制性酶酶切證實(shí)成功構(gòu)建了攜帶有2'-5'OAS啟動(dòng)子的pGL3-Basic真核表達(dá)載體。③RT-PCR和Western blot免疫印跡法顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-core真核表達(dá)質(zhì)粒的L02細(xì)胞中有HCV-core蛋白的表達(dá)。④在表達(dá)丙型肝炎病毒核心蛋白的L02細(xì)胞中熒光素酶活性為未轉(zhuǎn)染HCV-core表達(dá)質(zhì)粒的L02細(xì)胞中熒光素酶活性的415倍。 結(jié)論:①本實(shí)驗(yàn)成功克隆了長(zhǎng)度為241bp的OAS啟動(dòng)子基因,并構(gòu)建了OAS啟動(dòng)子-pGL3-Basic載體。②證實(shí)了丙型肝炎病毒核心蛋白對(duì)2′-5′OAS啟動(dòng)子有激活作用。③我們構(gòu)建的OAS啟動(dòng)子能高效特異地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。④本研究構(gòu)建的OAS啟動(dòng)子為丙型肝炎的基因治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to clone the oligoadenylate oligoadenylate oligoadenylate promoter gene and construct the OAS promoter -pGL3-basic vector, and to explore the application of OAS promoter in hepatitis C specific gene therapy. Methods the reported promoter sequence of OAS gene was used as the motherboard. Primers containing restriction endonuclease sites Hind 鈪，

本文編號(hào)：1608958