本文選題：葡萄球菌腸毒素　切入點：重組蛋白　出處：《天津大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)是由葡萄球菌產(chǎn)生的、已超過20種基因型報道的、氨基酸序列和結(jié)構(gòu)相似,具有潛在超抗原活性的一組食源性致病毒素。目前對新發(fā)現(xiàn)腸毒素結(jié)構(gòu)、功能活性的認識和不同型腸毒素的檢測鑒別尚缺乏有效手段。制備型特異性單抗對認識不同型腸毒素的結(jié)構(gòu)和功能、不同毒素的檢測鑒別、分析腸毒素基因簇的表達調(diào)控機制等具有重要意義。本研究通過構(gòu)建葡萄球菌腸毒素A(SEA)和O(SEO)的原核表達載體,應(yīng)用純化的重組葡萄球菌腸毒素制備了兩種腸毒素單克隆抗體,并對單抗特性做了研究。 應(yīng)用克隆的腸毒素基因sea、selo構(gòu)建pET28α原核表達載體,轉(zhuǎn)化重組菌BL21(DE3)表達,經(jīng)鎳鰲合層析純化獲得可溶性重組蛋白SEA-His、SEO-His。應(yīng)用已構(gòu)建的pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌BL21,經(jīng)誘導(dǎo)表達、親和層析純化獲得SEA-GST、SEO-GST重組蛋白,以此蛋白為免疫原免疫8周齡Balb/c小鼠,3次免疫后取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,制備雜交瘤細胞。以SEA-His、SEO-His為包被蛋白建立間接ELISA方法篩選陽性克隆,陽性率分別為8.5%(34/400)、5.3%(24/450)。有限稀釋法對SEA腸毒素陽性雜交瘤細胞4A2,SEO腸毒素陽性雜交瘤細胞5C12、8C7進一步亞克隆,獲得穩(wěn)定分泌抗重組腸毒素蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為A型:4A2-C5、4A2-B10;O型:5C12-C3、5C12-B4、8C7-G2、8C7-H8。 對亞克隆獲得的雜交瘤細胞株分泌的單抗特性進行了研究。經(jīng)間接ELISA檢測,4A2-C5、5C12-C3、8C7-G2雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價分別為1:1600、1:1600、1:6400,腹水效價分別達1:6.4×10~3、1:5.12×10~4、1:1.024×10~5;3株單克隆抗體4A2-C5、8C7-G2、5C12-C3親和常數(shù)分別為3.35×10~6、1.89×10~6、1.45×10~6;亞類鑒定結(jié)果顯示,4A2-C5、5C12-C3為IgG2b亞類;8C7-G2為IgM亞類。競爭ELISA對單抗識別抗原位點的分析結(jié)果表明,5C12-C3和8C7-G2分別識別SEO蛋白的不同抗原表位;Western blotting表明獲得的3株單克隆抗體均能識別相應(yīng)重組蛋白的B細胞線性表位;應(yīng)用SEB和SEC1腸毒素陽性血清的阻斷ELISA結(jié)果表明,SEA、SEO、SEB和SEC1腸毒素間存在交叉抗原。通過單抗特異性鑒定,結(jié)合腸毒素成熟肽氨基酸比對、表位預(yù)測、易接近性預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析,推斷獲得的3株單抗為葡萄球菌腸毒素群特異性抗體。這為葡萄球菌腸毒素功能特性的分析、檢測奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Staphylococcal enterotoxin SES (Staphylococcal enterotoxins) is a group of foodborne pathogenic toxins produced by Staphylococcal enterotoxins, which have been reported by more than 20 genotypes and have similar amino acid sequences and structures and have potential superantigen activity. The recognition of functional activity and the detection and identification of different types of enterotoxins are still lack of effective means. The specific monoclonal antibody pairs recognize the structure and function of different types of enterotoxins, and the detection and identification of different types of toxins. It is important to analyze the expression regulation mechanism of enterotoxin gene cluster. In this study, two monoclonal antibodies against staphylococcal enterotoxin were prepared by constructing prokaryotic expression vectors of staphylococcal enterotoxin (Staphylococcal enterotoxin), and using purified recombinant staphylococcal enterotoxin (staphylococcal enterotoxin). The characteristics of McAb were also studied. PET28 偽 prokaryotic expression vector was constructed by using the cloned enterotoxin gene seaselo. The recombinant protein SEA-His-SEO-Hiswas purified by nickel chelate chromatography. The recombinant protein was transformed into the host strain BL21 by using the constructed pEGX-6P-SEA and pEGX-6P-SEO expression vectors, and the expression was induced. SEA-GST-SEO-GST recombinant protein was purified by affinity chromatography. The SEA-GST-SEO-GST recombinant protein was used as immunogen to immunize 8-week-old Balb/c mice. The spleen cells of SEA-GST-SEO-GST were fused with SP2/0 myeloma cells. Hybridoma cells were prepared. SEA-His-SEO-His was used as coating protein to establish indirect ELISA method to screen positive clones, the positive rates were 8.5N 34 / 400 / 5.30.The subclone of SEA enterotoxin positive hybridoma cell line 5C128C7 was further subcloned by finite dilution method. Hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against recombinant enterotoxin protein were obtained and named as type A: type A: 4A2-C5, 4A2-B10O type: 5C12-C3, 5C12-B4, 8C7-G2C7-H8. The monoclonal antibody properties of hybridoma cell lines obtained by subcloning were studied. The titers of the supernatants of the culture supernatants of 4A2-C5C5-C12-C3O8C7-G2 hybridoma cells were 1: 16001: 1: 16001: 6400, and the ascites titers were 1: 6.4 脳 1031.12 脳 1035.12 脳 104w 1: 1.024 脳 105C 3 McAb 4A2-C5C5C5C7-G2O2C2C12-C3, respectively. The results of subclass identification showed that 4A2-C5C5C12-C3 was IgG2b subclass 8C7-G2 as IgM subclass. The results of competitive ELISA analysis of mAb recognition antigenic sites showed that the three McAbs identified by Western blotting could recognize different epitopes of SEO protein respectively. The B cell linear epitopes of the corresponding recombinant proteins can be recognized. The results of blocking ELISA with SEB and SEC1 enterotoxin positive serum showed that there were cross antigens between SEOSEB and SEC1 enterotoxin. The results of specific identification of monoclonal antibody, amino acid ratio of mature peptide of enterotoxin, epitope prediction, accessibility prediction, etc. It was deduced that the three monoclonal antibodies were specific antibodies to staphylococcal enterotoxin group, which laid a foundation for the analysis of the functional characteristics of staphylococcal enterotoxin.
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

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本文編號：1607975