本文選題：苯并(a)芘　切入點：MTT　出處：《華中科技大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：多環(huán)芳烴類化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)在環(huán)境中分布廣泛。其中苯并(a)芘(benzo[a]pyrene, BaP)是PAHs中最具代表性的環(huán)境致癌物。它主要來源于交通運輸、工業(yè)生產(chǎn)以及生活環(huán)境中有機物的熱分解與不完全燃燒。流行病學(xué)研究表明:BaP的暴露與人類多種腫瘤的發(fā)生有關(guān),如肺癌和皮膚癌。實驗研究發(fā)現(xiàn)BaP可阻斷細(xì)胞生長分化調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),與DNA形成加合物,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡。 細(xì)胞死亡包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死兩種形式。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自發(fā)的、程序性的死亡過程。壞死則是因病理而產(chǎn)生的被動死亡。當(dāng)調(diào)控細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子受抑制時,細(xì)胞的死亡形式則可能由凋亡轉(zhuǎn)為壞死。研究證據(jù)顯示:抑癌基因p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路參與BaP致細(xì)胞增值和凋亡中的調(diào)控。但是,p73在BaP致細(xì)胞死亡中的調(diào)控機制仍有待深入研究。 p73是p53的重要家族成員成員之一。它在結(jié)構(gòu)和功能上與p53有相似性。p73可激活p53下游調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡的靶基因,從而參與BaP致細(xì)胞DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)。然而,p73與p53在功能與激活機制上也有差異性。p73能否獨立于p53而介導(dǎo)BaP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死尚無確切報道。 基于此,本研究以人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)和p53缺失的人肺腺癌細(xì)胞(H1299)為靶細(xì)胞,設(shè)定BaP染毒組(8μM、16μM、32μM、64μM和128μM )、溶劑對照組(S9+DMSO+含%5血清培養(yǎng)基(S9終濃度為3‰DMSO終濃度1‰)和空白對照組處理細(xì)胞24 h。用MTT實驗和單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)分別評價細(xì)胞的活力和靶細(xì)胞DNA的損傷程度。同時,用流式細(xì)胞術(shù)評價BaP對靶細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯和死亡的影響。用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測p73主要上游基因及其下游細(xì)胞死亡和周期阻滯相關(guān)基因的mRNA水平,可望為進一步研究篇p53非依賴性信號通路在BaP致細(xì)胞死亡中的調(diào)控作用提供科學(xué)線索。本研究主要結(jié)果如下: 1.細(xì)胞活力實驗 用設(shè)定濃度的BaP染毒(8μM、16μM、32μM、64μM和128μM )處理MRC-5和H1299細(xì)胞24 h時。在MRC-5細(xì)胞,與溶劑對照組相比,除8μM BaP染毒組外,其它BaP處理組細(xì)胞的存活率均顯著下降(P0.05);128μM BaP染毒組的細(xì)胞存活率降低了30%。在H1299細(xì)胞,所有BaP染毒組的細(xì)胞存活率均顯著性降低(P0.05),并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。相對溶劑對照相細(xì)胞而言,32μM BaP染毒組細(xì)胞的存活率降低了40%。 2.單細(xì)胞凝膠電泳實驗 用設(shè)定濃度的BaP分別染毒MRC-5細(xì)胞和H1299細(xì)胞24 h。在MRC-5細(xì)胞,與溶劑對照組相比,各BaP處理組細(xì)胞的DNA損傷程度均顯著增加(P0.01),峰值在在64μM BaP染毒組。在H1299細(xì)胞,BaP致DNA損傷程度是隨著染毒濃度的增加而顯著增加(P0.01),有劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。 3.流式細(xì)胞術(shù)實驗 用設(shè)定濃度的BaP分別染毒MRC-5細(xì)胞和H1299細(xì)胞24 h,用流式細(xì)胞術(shù)檢測各時相細(xì)胞數(shù)。在MRC-5細(xì)胞,與溶劑對照組相比,BaP主要引起G1期細(xì)胞阻滯。所有染毒組的凋亡細(xì)胞數(shù)量與溶劑對照組相比均無顯著性差異(P0.05)。但是,所有染毒組的壞死細(xì)胞數(shù)量百分比與溶劑對照組相比均顯著性增加(P0.05)。在H1299細(xì)胞,BaP引起的細(xì)胞周期阻滯則主要在G2期。所有BaP染毒組的壞死細(xì)胞數(shù)量百分比與溶劑對照組相比均顯著性增加(P0.05);相對MRC-5細(xì)胞的各染毒組均顯著性升高(P0.05)。但是,凋亡細(xì)胞數(shù)僅在128μM BaP染毒組有顯著性增加(P0.05)。 4.實時熒光定量PCR實驗 用設(shè)定濃度的BaP染毒MRC-5細(xì)胞24 h,除16μM BaP染毒組外,其它染毒組ATM基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P0.05)。E2F1和Bcl-2基因mRNA僅在16μM和128μM BaP染毒組有顯著性表達(dá)(P0.05)。除16μM和128μM BaP染毒組外,其它染毒組的Puma基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P0.05)。所有染毒組p53,p73和p21基因的mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P0.05)。但是,在所有BaP染毒組并未檢出14-3-3σ,ATR,Bax,Noxa和caspase3基因mRNA的顯著性表達(dá)(P0.05)。 用設(shè)定濃度的BaP染毒H1299細(xì)胞24 h,除32μM和64μM BaP染毒組外,其它染毒組ATM和ATR基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P0.05)。E2F1, p73和Puma基因mRNA在所有BaP染毒組均有顯著性表達(dá)(P0.05)。除64μM BaP染毒組外,其它染毒組Bcl-2基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P0.05)。但是,在所有BaP染毒組均未檢出Gadd45,Bax,Noxa和caspase3基因mRNA的顯著性表達(dá)(P0.05)。 以上研究結(jié)果表明:在本實驗條件下,BaP導(dǎo)致了MRC-5細(xì)胞和H1299細(xì)胞存活率的降低和較強的DNA損傷。BaP誘導(dǎo)的DNA損傷可能激活了p73在mRNA水平參與的p53非依賴性細(xì)胞壞死信號調(diào)控通路。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 余應(yīng)年;DNA鏈斷裂與DNA損傷和細(xì)胞凋亡[J];癌變.畸變.突變;1999年06期

2 沈行良;翁啟芳;;p53和mdm2基因[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2007年01期

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本文編號：1605681