本文選題：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2　切入點(diǎn)：脂肪源性干細(xì)胞　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的：構(gòu)建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2基因的真核表達(dá)載體-重組質(zhì)粒pcDNA3.1-hBMP-2,利用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導(dǎo)pcDNA3.1-hBMP-2轉(zhuǎn)染兔脂肪干細(xì)胞,從而探討在自身表達(dá)的hBMP.2誘導(dǎo)下兔脂肪干細(xì)胞成骨分化的效果,為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程骨做準(zhǔn)備。 方法：1、設(shè)計(jì)和合成引物,并通過PCR擴(kuò)增hBMP.2基因。2、使用BamHI/EcoRI分別對(duì)hBMP-2基因和質(zhì)粒pcDNA3.1進(jìn)行酶切,將酶切產(chǎn)物相互連接；經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后,抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定。3、取三月齡新西蘭大白兔頸背部脂肪組織進(jìn)行脂肪干細(xì)胞的獲得并培養(yǎng)、擴(kuò)增。4、利用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000分別介導(dǎo)hBMP-2基因和EGFP基因轉(zhuǎn)染第4代脂肪干細(xì)胞,并使用濃度為400μg/ml G418對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行篩選。5、通過熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染48h后可發(fā)綠色熒光細(xì)胞的個(gè)數(shù)明確瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。6、通過MTT比色法繪制hBMP-2組(實(shí)驗(yàn)組)、EGFP組(陰性對(duì)照組)及未轉(zhuǎn)染組(空白對(duì)照組)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。7、用ELISA法定量檢測(cè)各組第3天、第7天、第14天、第21天的連續(xù)三天細(xì)胞上清液中的hBMP-2含量。8、成骨分化指標(biāo)的檢測(cè)：對(duì)轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)7天的細(xì)胞進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色；使用ALP活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)各組第3天、第7天、第14天細(xì)胞上清液中的ALP活性；使用2%茜素紅對(duì)轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)14天的細(xì)胞進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色。結(jié)果：1、經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了hBMP-2基因；通過轉(zhuǎn)化擴(kuò)增抽提出的重組質(zhì)粒行BamHI/EcoRI酶切后獲得約1200 bp和5400bp兩個(gè)片段；其DNA測(cè)序結(jié)果與Genbank中報(bào)道的hBMP-2基因序列一致。2、脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000可以介導(dǎo)pcDNA3.1-hBMP-2和pcDNA3.1-EGFP成功轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞,通過計(jì)算得出其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染率為(18.0±0.42)%,并經(jīng)過濃度為400μg/mlG418篩選后獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。MTT比色法繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線觀察表明：脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導(dǎo)的目的基因轉(zhuǎn)染對(duì)脂肪干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖無明顯影響。3、連續(xù)三天細(xì)胞培養(yǎng)上清液hBMP-2 ELISA檢測(cè)表明hBMP-2組在第3天、第7天、第14天、第21天時(shí)的hBMP-2表達(dá)量均高于相應(yīng)時(shí)段的EGFP組及未轉(zhuǎn)染組(組間p0.05),且能夠穩(wěn)定表達(dá)(組內(nèi)p0.05)。根據(jù)hBMP-2標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線換算,在上述培養(yǎng)時(shí)段內(nèi),hBMP-2組細(xì)胞上清液中的hBMP-2含量約12.36ng hBMP-2(細(xì)胞接種濃度8×104個(gè)/孔)。4、成骨分化指標(biāo)：Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示hBMP-2組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出Ⅰ型膠原,均高于EGFP組及未轉(zhuǎn)染組(p0.05)經(jīng)堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)段上清液中的ALP活性發(fā)現(xiàn)hBMP-2組均較EGFP組及未轉(zhuǎn)染組高(組間p0.05)且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)hBMP-2組ALP的活性逐漸增強(qiáng)(組內(nèi)p0.05) 2%茜素紅對(duì)轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)14天的細(xì)胞進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)僅hBMP-2組有較多橘紅色結(jié)節(jié),而EGFP組及未轉(zhuǎn)染組無明顯發(fā)現(xiàn)。結(jié)論：成功構(gòu)建了hBMP-2基因的真核表達(dá)載體-重組pcDNA3.1-hBMP-2質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000可以介導(dǎo)hBMP-2基因成功轉(zhuǎn)染ADSCs,并對(duì)ADSCs的生長(zhǎng)、增殖無明顯影響,并可通過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染hBMP-2基因的ADSCs能夠穩(wěn)定高效地表達(dá)hBMP-2,并能在自身表達(dá)的hBMP-2誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞進(jìn)行分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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