本文選題：17β-雌二醇　切入點(diǎn)：內(nèi)皮祖細(xì)胞　出處：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:觀察17β-雌二醇(17β-estradiol, 17β-E2,以下簡(jiǎn)稱E2)對(duì)由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)凋亡的影響及其影響機(jī)制,旨在探討雌激素抑制動(dòng)脈粥樣硬化和減少女性冠心病的可能機(jī)制。過去有關(guān)雌激素對(duì)EPCs影響的研究多著重于促進(jìn)EPCs增殖遷移和血管生成方面,而對(duì)EPCs凋亡方面則重視不夠。本實(shí)驗(yàn)使用ox-LDL作為誘導(dǎo)劑來觀察E2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的前體EPCs凋亡的影響。由于ox-LDL在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)中的重要地位,因此雌激素抑制由ox-LDL誘導(dǎo)的凋亡更能說明其抗AS作用。本研究還就E2對(duì)抑制凋亡的機(jī)制和途徑進(jìn)行觀察,即觀察E2是否通過其受體起作用,是否與PI3K/Akt途徑有關(guān)。方法:(1)外周單個(gè)核細(xì)胞的分離:肝素抗凝抽取人外周血50ml(肝素1000U)。PBS對(duì)倍稀釋,按1:1加在人淋巴細(xì)胞分離液上,2000R/min離心,吸取中間白膜層單個(gè)核細(xì)胞,1500R/M離心洗滌三次,取細(xì)胞懸液與等體積2g/L臺(tái)盼藍(lán)混合,進(jìn)行細(xì)胞活力計(jì)算(死細(xì)胞-藍(lán)色、活細(xì)胞不著色),活細(xì)胞數(shù)占98%以上可進(jìn)行接種。以上在抽取血樣后四小時(shí)內(nèi)完成。(2)誘導(dǎo)分化:纖連蛋白用PBS溶解稀釋為1 ng/ml后包被24孔板,每孔中加入100ul ,置于37℃溫箱中孵育2h ,臨用前吸出多余的液體,用PBS洗滌兩次。分用M199培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度,接種于培養(yǎng)瓶中,成纖維細(xì)胞多于24小時(shí)內(nèi)貼壁,因此培養(yǎng)24小時(shí)后取未貼壁細(xì)胞以4×106/cm2密度接種于包被有纖維連接蛋白(FN)的24孔培養(yǎng)板(每孔M199培養(yǎng)液1 ml),添加10 %胎牛血清、1 %青鏈霉素(1萬單位/ml)、VEGF 50 ng/ml、b-FGF 1 ng/ml,置于5%CO2、飽和濕度、37oC孵育箱中培養(yǎng)四天,用磷酸鹽緩沖液洗掉非貼壁細(xì)胞,換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7d ,進(jìn)一步用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。(3)EPCs鑒定:利用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞表抗CD34及VEGFR-2 ;利用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表抗CD 133;用EPCs特異性抗體DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。(4)EPCs調(diào)亡的觀察:采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Annexin-v、碘化丙錠(PI)雙染色免疫熒光法檢測(cè)EPCS的凋亡。貼壁細(xì)胞直接用蓋玻片來培養(yǎng)7d后,用PBS洗滌兩次,在500ul的Binding Buffer中加入2ul異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Annexin-v、5ul PI混勻。將上述溶液加于蓋玻片表面,使長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋,避光,室溫反應(yīng)10分鐘。將蓋玻片倒置于載玻片上,于熒光顯微鏡下雙色濾光片觀察。(5)E2對(duì)EPCs凋亡的觀察:用不同濃度E2干預(yù)經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)凋亡的EPCs,觀察其劑量依賴性及時(shí)間依賴性。(6)機(jī)制研究加入雌激素受體阻斷劑ICI182,780及PI3K抑制劑LY294002后觀察凋亡的影響。結(jié)果:1. E2對(duì)EPCs的自然凋亡有抑制作用,100 nmol/L濃度E2作用下的凋亡率為(8.23±0.6)%,與空白對(duì)照組(12.31±0.34)%的凋亡率相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2. E2抑制ox-LDL誘導(dǎo)的EPCs凋亡具有劑量依賴性。在E2濃度10nmol/L-100 nmol/L范圍內(nèi)隨著其濃度的增加,在干預(yù)24h后檢測(cè),其抗凋亡的作用逐漸增強(qiáng)。在10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L濃度E2下凋亡率依次為(22.39±0.68)%、(20.42±2.56)%、(13.93±0.3)%,與ox-LDL誘導(dǎo)組(31.43±1.05)%的凋亡率比較,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在干預(yù)48h后檢測(cè)凋亡率依次為(23.28±0.64)%、(19.25±1.16)%、(14.57±0.45)% ,與24h結(jié)果的比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.雌激素受體阻斷劑ICI182,780與PI3K抑制劑LY294002能夠明顯抑制E2的抗凋亡作用,加入雌激素受體阻斷劑ICI182,780組的凋亡率上升至(28.6±1)%,加入PI3K抑制劑LY294002組的凋亡率上升至(25.2±1)%,與E2組(13.9±0.3)%的凋亡率相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1.17β-雌二醇具有抑制人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的作用。2.ox-LDL具有誘導(dǎo)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的作用,而17β-雌二醇可以呈濃度依賴性的對(duì)抗ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的作用。3.17β-雌二醇抑制ox-LDL誘導(dǎo)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制與雌激素受體及PI3K通路有關(guān)。
[Abstract]:Objective: To observe the effect of 17 beta estradiol (17 P -estradiol, 17 P -E2, hereinafter referred to as E2) by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) induced vascular endothelial progenitor cells (endothelial progenitor cells, EPCs) apoptosis and its influence mechanism, aims to explore the estrogen suppression of atherosclerosis and possible mechanisms for reducing coronary heart disease in women the study of the past. The influence of EPCs on estrogen more focus on promoting the proliferation and migration of vascular EPCs, and apoptosis of EPCs is not enough attention. This experiment using ox-LDL as an inducer to observe precursor EPCs on apoptosis of endothelial cells. Because of the E2 ox-LDL in atherosclerosis (AS) plays an important role in therefore, estrogen inhibits the apoptosis induced by ox-LDL can explain its anti AS effect. This research also studied the mechanism of E2 apoptosis and the way is to observe whether E2 works through its receptor 鐢，

本文編號(hào)：1598041