本文選題：外源性硫化氫　切入點：鈣化　出處：《南華大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 背景與目的:異位鈣化即非骨組織發(fā)生礦物質(zhì)沉積,主要是鈣鹽沉積,血管組織鈣化是其中的一種,分為中膜鈣化和內(nèi)膜鈣化。后者與動脈粥樣硬化密切相關(guān),早期參與的細胞主要是巨噬細胞和肥大細胞。硫化氫具有重要的心血管生理與病理作用,本實驗擬利用硫氫化鈉(Sodium hydrosulfide, NaHS)作為硫化氫的外源性供體,在β-甘油磷酸鈉(β-sodium glycerophosphate,β-GP)和氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,oxLDL)誘導的巨噬細胞鈣鹽沉積的模型上研究外源性硫化氫對巨噬細胞吞噬脂質(zhì)過程中鈣化的影響及其發(fā)揮作用的影響因素,為進一步探討其對內(nèi)膜鈣化的作用提供實驗依據(jù)。 方法: 實驗1:細胞模型的建立:小鼠單核巨噬細胞用5mmol/L的β-甘油磷酸鈉和40mg/mL的oxLDL孵育3天,Von kossa染色形態(tài)學觀察細胞鈣鹽沉積,原子吸收分光光度法測定細胞鈣含量。 實驗2:外源性硫化氫對巨噬細胞吞噬脂質(zhì)過程中細胞鈣化的影響 (1)不同濃度NaHS對細胞鈣化的影響:小鼠單核巨噬細胞在鈣化條件培養(yǎng)同時加入不同濃度的NaHS(0,25,50,100,200μmol/L)孵育6天,原子吸收分光光度法測量細胞鈣含量,?液閃爍儀檢測鈣沉積,Western blot檢測OPN蛋白和RT-PCR檢測OPN mRNA表達。 (2)不同時間NaHS處理對細胞鈣化的影響:小鼠單核巨噬細胞在鈣化條件培養(yǎng)同時加入最佳作用濃度NaHS分別孵育細胞0、2、4、6天(D)。原子吸收分光光度法和?液閃爍儀分別觀察細胞鈣含量及沉積,Western blot及RT PCR分別測定OPN蛋白和OPN mRNA表達情況。 實驗3:外源性硫化氫對細胞鈣化作用的影響因素的探討 (1)氧化作用:用400μmol/L過氧化氫刺激細胞內(nèi)活性氧水平升高,觀察活性氧對硫化氫作用的影響,原子吸收分光光度法和?液閃爍儀分別觀察細胞鈣含量及沉積,Western blot及RT PCR分別測定OPN蛋白和OPN mRNA表達情況。 (2)炎癥因子的作用:給予10ng/mL外源性炎癥因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)刺激,觀察其對硫化氫作用的影響。原子吸收分光光度法和?液閃爍儀分別觀察細胞鈣含量及沉積,Western blot及RT PCR分別測定OPN蛋白和OPN mRNA表達情況。 結(jié)果: 1.與正常對照組細胞相比,ox-LDL與β-甘油磷酸鈉共孵育的細胞,Von kossa染色后可見細胞內(nèi)有大量的黑色顆粒沉積,鈣含量比正常細胞內(nèi)高7.7倍(p 0.05)。而單獨用ox-LDL或β-甘油磷酸鈉孵育細胞,細胞內(nèi)僅見少量的黑色顆粒沉積。說明巨噬細胞在ox-LDL和甘油磷酸鈉共孵育誘導下可明顯促進細胞內(nèi)鈣鹽積聚沉積。 2.與鈣化組細胞相比,隨著NaHS濃度和作用時間的增加,細胞鈣含量和鈣沉積逐漸減少,OPN蛋白和mRNA表達也逐漸減少,特別是100μmol/LNaHS作用4D組與未用NaHS(即0μmol/L)組相比,鈣含量和鈣沉積分別減少6.5倍和7.2倍(p 0.05),OPN蛋白和mRNA表達也分別減少了5倍和4.8倍(p 0.05)。 3.與正常細胞組相比,鈣化組細胞內(nèi)活性氧明顯增加,加入H2O2后,NaHS抑制鈣鹽沉積作用被阻止,細胞鈣鹽沉積加重,與NaHS處理組相比,OPN mRNA和蛋白表達上升2.9倍和3.1倍(p 0.05),細胞鈣含量和鈣沉積增加了6.7倍和7.1倍(p 0.05)。 4.鈣化細胞炎癥因子腫瘤壞死因子-?(TNF-?)產(chǎn)生增多,加入炎癥因子白介素-6(IL-6)后,NaHS抑制鈣鹽沉積作用被阻止,細胞鈣化加重。 結(jié)論: 1. ?-甘油磷酸鈉和ox-LDL聯(lián)合應(yīng)用可成功復制巨噬細胞鈣化模型 2.外源性硫化氫以濃度和時間依賴性方式緩解巨噬細胞吞噬脂質(zhì)過程中的鈣鹽沉積,推測可抑制內(nèi)膜鈣化。 3.炎癥因子IL-6和氧化作用可阻止外源性硫化氫對巨噬細胞吞噬脂質(zhì)過程中鈣鹽沉積的抑制作用。
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【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：1597028