本文選題：單克隆抗體　切入點：脂多糖　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 膿毒癥是ICU病人最常見的死亡原因,盡管其醫(yī)療投入巨大,嚴重膿毒癥的死亡率還是居高不下,可達25%-30%,而膿毒癥休克的死亡率則更高,達到了40%-70%。 膿毒癥可由多種病原微生物感染引起,包括革蘭氏陽性(G~+)菌、革蘭氏陰性(G~-)菌和真菌等等,而其中G~-菌感染是最重要的一種,占總發(fā)病人數(shù)的40%以上。脂多糖(LPS)是G~-菌細胞壁的重要組成成分,也是G~-菌感染膿毒癥中最主要的毒力因子和抗原成分。所以在G~-菌感染引起的膿毒癥的診斷與治療中,LPS是一個重要的靶點。目前尚無LPS拮抗劑用于臨床應(yīng)用或進入臨床觀察,但有證據(jù)顯示,預(yù)存抗LPS抗體與敗血癥的發(fā)生、大樣本住院腫瘤患者、燒傷、外科手術(shù)等因感染死亡的病人數(shù)呈負相關(guān),即對LPS誘發(fā)的病理進程有明確的保護作用。動物實驗顯示針對LPS的單克隆抗體(mAb)對實驗性膿毒癥動物模型具有良好的保護作用。所以,抗LPS的mAb有可能成為治療G~-菌感染誘發(fā)的膿毒癥的一種新制劑。 LPS由三部分組成:O特異性抗原,也叫O抗原或體抗原,位于G~-菌細胞壁的最外面,由一長鏈多糖構(gòu)成;核心寡糖,是一由大約10個左右的單糖組成的寡糖;類脂A。所以,脂多糖是一結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、具有多種異質(zhì)性的生物大分子,而且屬于胸腺非依賴抗原(TI)抗原。與蛋白質(zhì)等胸腺依賴(TD)抗原不同,TI抗原不能誘導(dǎo)抗體親和成熟,也不能誘導(dǎo)免疫記憶,所以按常規(guī)的免疫方法很難產(chǎn)生高親和力、交叉反應(yīng)性抗LPS的mAb。為解決此難題,一個可行的方法就是用分子模擬技術(shù),即用蛋白質(zhì)、多肽來模擬LPS的抗原結(jié)構(gòu),從而將多糖類TI抗原轉(zhuǎn)變?yōu)槎嚯念怲D抗原,提高抗原的免疫原性。那么,篩選出能夠模擬LPS抗原結(jié)構(gòu)的多肽就成為其中關(guān)鍵的一步。 噬菌體展示技術(shù)是一種用于篩選和改造功能性短肽和蛋白質(zhì)強有力的生物技術(shù),廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。事實上,噬菌體展示技術(shù)早已成功的應(yīng)用于多糖表位的模擬肽篩選,如對腦膜炎奈瑟球菌A、B、C三種血清型的莢膜多糖的模擬肽篩選。這些結(jié)果說明,用噬菌體展示技術(shù)可以篩選出模擬多糖抗原表位的模擬肽,從而將TI抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門D抗原,誘導(dǎo)強而有力的記憶性免疫應(yīng)答,制備出高親和力、交叉反應(yīng)性抗LPS的mAb。 所以,本課題的主要研究思路是:利用噬菌體展示技術(shù)篩選并合成模擬LPS保守抗原表位的多肽,將其抗原表位的化學(xué)性質(zhì)由脂多糖改變?yōu)槎屉?由此使TI抗原改變?yōu)門D抗原;然后將多肽與適當(dāng)?shù)妮d體進行交聯(lián),用交聯(lián)物作為免疫原免疫BALB/c小鼠,制備具有高親和力、廣泛交叉反應(yīng)性的抗LPS的mAb。最后對其在動物體內(nèi)、外的保護活性進行初步探討。 本課題組在前期工作中,以具有交叉保護活性的抗鼠傷寒沙門氏菌多克隆抗體為配基成功的從噬菌體環(huán)七肽庫中篩選到四個可模擬LPS表位的保守序列,其免疫原性和抗原性已通過一系列實驗得以證實。其中一個模擬肽經(jīng)加入延長序列被命名為13L,我們的前期實驗顯示,用13L交聯(lián)藍載體(BC)作為免疫原免疫BALB/c小鼠后,可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對G~-菌感染和內(nèi)毒素休克的保護作用。以這些實驗結(jié)果為依據(jù),本實驗選擇13L作為候選模擬肽,交聯(lián)BC后免疫BALB/c小鼠,制備抗LPS的單克隆抗體。本研究包括以下兩個部分: 一、抗脂多糖單克隆抗體的制備及鑒定 模擬肽13L的篩選與合成按照本課題組以前建立的方法進行,現(xiàn)簡述如下:以大腸桿菌LPS L2630為配體用親和層析法從抗鼠傷寒沙門氏菌兔血清中純化出抗LPS的多克隆抗體;以純化的多克隆抗體為配體從環(huán)七肽庫中篩選出模擬LPS抗原表位的多肽,其中的一個親和力較強的多肽被命名為L7;為了增加L7的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,我們在其氨基酸序列兩側(cè)各加入兩個額外的氨基酸,并命名為13L,然后交由生物公司進行合成。 由于短肽分子量過低而不具備免疫原性,遂將其與藍載體通過交聯(lián)劑EDC的作用而進行交聯(lián),將交聯(lián)物13L-BC作為本次實驗的免疫原。 用13L-BC免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,共免疫7次,免疫程序如下:第1次免疫,將13L-BC與福氏完全佐劑(CFA)充分乳化后,小鼠足墊、皮下多點注射,1mg/ml,100μl/只,3周后進行第二次免疫;第2-5次免疫,將13L-BC與福氏不完全佐劑(IFA)充分乳化后,小鼠足墊、皮下多點注射,1mg/ml,100μl/只,每次間隔2周;第6次免疫,將煮沸處理過的大腸桿菌O111:B4和鼠傷寒桿菌直接行小鼠腹腔注射,5×10~6CFU/只;第七次免疫,2周后,小鼠眼眶靜脈采血并包被L2630和L7261用間接ELISA檢測血清中抗LPS抗體的滴度,抗體滴度高的小鼠再尾靜脈注射10μg L2630加強免疫一次。 3天后,處死小鼠,取其脾細胞與NS-1細胞融合制備雜交瘤,用L2630和L7261進行復(fù)合篩選,對雙陽性孔進行克隆化。連續(xù)三次克隆化100%陽性后,擴大培養(yǎng)雜交瘤細胞,收集雜交瘤細胞行小鼠腹腔注射制備腹水,用親和層析法從制備的腹水中純化單克隆抗體。 共融合3次,融合率在60%-100%之間,陽性率在1%-5%之間。通過篩選、克隆化最后獲得一株能穩(wěn)定分泌抗LPS抗體的雜交瘤細胞,命名為SMU-3A8。包被L2630檢測SMU-3A8的腹水效價和純化抗體效價,結(jié)果分別為1:1×10~6和8ng/ml。經(jīng)IgG亞類鑒定試劑盒鑒定,SMU-3A8的亞類為IgG2a。用間接ELISA、WesternBlot、Dot-ElISA、免疫熒光和流式細胞術(shù)顯示SMU-3A8可以和四種商品化的LPS反應(yīng),即大腸桿菌O111∶B4型LPS(L2630)、大腸桿菌O127∶B8型LPS(L3880)、鼠傷寒沙門氏菌LPS(L7261)和腸炎沙門氏菌LPS(L6761),其親和力分為4.9×10~8L/mol、1.6×10~7L/mol、4.2×10~8L/mol和1.5×10~7L/mol。并可以和七種G~-菌(大腸桿菌O111∶B4,大腸桿菌O127∶B8,鼠傷寒沙門氏菌,福氏痢疾桿菌,綠膿假單胞菌,結(jié)腸炎耶爾森菌,鼠疫耶爾森菌)的超聲上清及細菌全菌反應(yīng),但不能和金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌等G~+菌反應(yīng)。說明SMU-3A8是具有廣泛交叉反應(yīng)活性的抗LPS單克隆抗體。 二、抗脂多糖單克隆抗體的體內(nèi)、外保護活性 在第一部分實驗中,我們已成功的制備了一株能與多種商品化LPS和G~-菌具有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體SMU-3A8。我們用補體依賴細胞毒試驗和SMU-3A8對LPS刺激單核細胞產(chǎn)生NO的影響來檢測其體外活性;用SMU-3A8對致死量G~-菌感染小鼠存活率的影響以及對內(nèi)毒素休克小鼠存活率的影響來檢測其體內(nèi)活性,具體過程如下: 1.補體介導(dǎo)的細胞毒試驗細菌37℃振蕩培養(yǎng)5小時后,室溫8000rpm,離心10分鐘,用無菌PBS洗滌三次并調(diào)整細菌濃度為10~4CFU/ml。然后按體積1∶1的比例加入倍比稀釋的SMU-3A8(初始濃度10μg/ml),轉(zhuǎn)入到96孔培養(yǎng)板中,180μl/孔,加入豚鼠血清,20μl/孔,設(shè)不加抗體及不加補體的空白對照組。37℃反應(yīng)1小時后,每孔取出10μl用無菌PBS稀釋20倍至終體積200μl,然后均勻涂布于LB平板上,37℃過夜培養(yǎng),計數(shù)形成的細菌集落。 結(jié)果顯示,在補體存在的情況下,SMU-3A8并不能對金葡菌、大腸桿菌、鼠傷寒菌和痢疾桿菌構(gòu)成殺傷作用。 2.SMU-3A8對LPS刺激單核巨噬細胞產(chǎn)生NO的影響小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7為本實驗的靶細胞。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為10~6個/ml,加入到24孔培養(yǎng)板中,500μl/孔。然后同時加入終濃度為10μg/ml的L2630和倍比稀釋的SMU-3A8,設(shè)同型對照和空白對照。37℃培養(yǎng)24小時后,收集上清,用NO檢測試劑盒檢測上清中NO的濃度。 結(jié)果顯示,在較高濃度下(≥10μg/ml)SMU-3A8對L2630刺激RAW264.7產(chǎn)生NO有一定的抑制作用,如在10μg/ml時,其抑制率為20%左右。 3.SMU-3A8對細菌感染和內(nèi)毒素休克小鼠模型的保護作用參照本課題組以前建立的G~-菌感染和內(nèi)毒素休克動物模型,并做了適當(dāng)調(diào)整,作為本次實驗的動物模型。G~-菌過夜培養(yǎng)后用無菌PBS調(diào)整濃度,BABL/c小鼠腹腔注射,使其在4-7天時,死亡率為100%。BALB/c小鼠尾靜脈直接注射LPS來制備內(nèi)毒素休克模型,200μg/只,使其在12-36小時死亡率為100%。細菌或LPS注射2小時前,于小鼠尾靜脈注射不同濃度的SMU-3A8,設(shè)同型對照和空白對照。觀察并記錄小鼠的存活情況。 結(jié)果顯示,SMU-3A8在高濃度時能將鼠傷寒感染小鼠的死亡率從100%降低到75%左右,對大腸桿菌,痢疾桿菌感染小鼠則沒有保護作用。對本實驗中的內(nèi)毒素休克模型也沒有保護作用。 結(jié)論 在本實驗中,我們用模擬肽模擬LPS的抗原表位并將模擬肽與藍載體交聯(lián)作為免疫原,成功制備了一株具有交叉反應(yīng)活性的抗LPS mAb SMU-3A8。ELISA,Dot-ELISA,Western Blotting,免疫熒光,流式細胞檢測結(jié)果顯示,SMU-3A8可以和四種商品化的LPS以及七種G~-菌反應(yīng),但不和G~+菌反應(yīng)。體內(nèi)、外保護實驗顯示,SMU-3A8可以減少L2630刺激小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7產(chǎn)生NO的量,并可以提高鼠傷寒菌感染小鼠的存活率,具有一定的保護作用。 據(jù)我們所知,還未有用模擬肽制備抗LPS mAb的報道,我們的實驗為多糖等TI抗原的mAb制備提供了一個新策略。SMU-3A8具有交叉反應(yīng)性和一定的保護活性,有可能成為LPS研究的一個重要的工具,在臨床G~-菌感染的診斷和治療中也可能會發(fā)揮一定作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【引證文獻】

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1 王涵;鐵皮石斛素新成分的分離與功效鑒定[D];吉林大學(xué);2012年

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本文編號：1596672