本文選題：關(guān)咳嗽　切入點(diǎn)：感染后咳嗽　出處：《廣州醫(yī)學(xué)院》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景及目的: 咳嗽是急性上呼吸道感染(URI)最突出的的癥狀。急性咳嗽定義為咳嗽在3周以內(nèi),URI是其最常見的原因。而感染后咳嗽是患者在經(jīng)歷了急性URI之后,感染本身癥狀消失,咳嗽仍然遷延不愈,持續(xù)時(shí)間大于3周而胸部X線檢查正常,又稱感冒后咳嗽,一般由病毒感染引起,以副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)較為常見。URI之后,大約有11%～25%的人患感染后咳嗽。然而,對于病毒感染引起的咳嗽,目前仍然缺乏滿意的治療。至今,有關(guān)感染后咳嗽的真正機(jī)制知之甚少,還沒有真正病毒性咳嗽的動(dòng)物研究。因此,進(jìn)行病毒感染引起的咳嗽,尤其是感染后咳嗽發(fā)病機(jī)制的研究將有助于揭露疾病的本質(zhì),對提供治療方向具有相當(dāng)重要的意義。 咳嗽反射敏感性(CRS)異常增高是機(jī)體咳嗽反應(yīng)的一個(gè)十分重要的原因。由感覺神經(jīng)末梢(主要是C纖維末梢)釋放的神經(jīng)肽所介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥可能在CRS改變以及咳嗽發(fā)病中起重要作用。病毒感染可以通過多種機(jī)制引起神經(jīng)肽水平升高。有臨床研究發(fā)現(xiàn),URI后咳嗽患者CRS升高是其主要特征。但是,迄今為止,針對URI引起的CRS改變的研究,僅限于少數(shù)報(bào)道。那么,在病毒感染引起的咳嗽中,CRS如何改變?CRS與氣道神經(jīng)源性炎癥之間關(guān)系如何?神經(jīng)肽是否參與以及哪些神經(jīng)肽起主要作用呢?為了更好地闡述這些問題,本研究將通過制作豚鼠人副流感病毒三型(PIV3)和RSV感染咳嗽模型,動(dòng)態(tài)觀察豚鼠CRS的改變和氣道神經(jīng)源性炎癥,以及它們之間的關(guān)系,從多方面深入探討病毒感染引起的咳嗽,尤其是感染后咳嗽的發(fā)病機(jī)制。 主要結(jié)果及結(jié)論: SPF級豚鼠隨機(jī)分成十組,即正常對照組,兩個(gè)病毒感染組以及哮喘組,每個(gè)感染組又按病毒感染后天數(shù)分為6, 12, 28和42天四個(gè)組。每組十只。 1.分別制作PIV3和RSV感染豚鼠咳嗽模型,免疫熒光和熒光定量PCR(FQ-PCR)方法分別檢測病毒抗原和核酸,證實(shí)PIV3和RSV成功感染豚鼠;支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞學(xué)及肺組織病理學(xué)顯示感染組急性期以氣道炎癥改變?yōu)橹?未見肺實(shí)質(zhì)炎癥。表明豚鼠PIV3和RSV感染急性和感染后咳嗽模型成功建立。 2.辣椒素咳嗽激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果顯示所有感染組CRS均明顯增高,與URI引起的咳嗽的臨床特點(diǎn)相符,急性感染期部分豚鼠伴氣道高反應(yīng)性(AHR)。哮喘對照組模型氣道反應(yīng)性(AR)明顯增加而CRS無明顯改變。 3. PIV3模型豚鼠各組肺組織P物質(zhì)(SP)含量,12、28和42天組神經(jīng)肽受體1(NK1)及各組辣椒素受體亞型1(VR1)的mRNA水平均明顯上升。6、12和28天組SP,42天組蛋白基因產(chǎn)物(PGP-9.5),28和42天組VR1及神經(jīng)絲(NF)200的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),提示引起了神經(jīng)源性炎癥。 4. RSV模型豚鼠各組肺組織SP含量,12、28和42天組NK1以及6、12和28天組VR1的mRNA水平均明顯升高;12和28天組SP、28天組VR1以及12天組PGP-9.5的蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng),同樣提示引起了神經(jīng)源性炎癥。 5.兩種咳嗽模型豚鼠CRS及神經(jīng)肽的變化均呈一定的時(shí)空分布特點(diǎn),PIV3和RSV核酸含量均隨感染后時(shí)間延長逐步明顯降低,感染性氣道炎癥則逐漸恢復(fù);而CRS、SP含量以及NK1和VR1的基因表達(dá)普遍達(dá)到高峰或維持較高水平,神經(jīng)肽的蛋白表達(dá)則多在28天前后顯著增強(qiáng)。均提示神經(jīng)源性炎癥可能在感染后咳嗽的發(fā)病中起重要作用。 6. PIV3模型豚鼠6和28天組肺組織SP含量,12、28和42天組NK1及各組VR1的mRNA水平均與CRS呈正相關(guān);而6、12和42天組SP,12和28天組VR1,12天組PGP9.5以及28天組NF-200的蛋白表達(dá)與CRS呈正相關(guān)。RSV模型豚鼠各組肺組織SP含量和NK1以及12、28天組VR1的mRNA水平均與CRS呈正相關(guān);而6、12和28天組SP以及6、28天組PGP9.5的蛋白表達(dá)與CRS呈正相關(guān)。 7.兩種模型均發(fā)現(xiàn)多數(shù)神經(jīng)肽及相關(guān)受體與CRS呈正相關(guān),提示可能是CRS增高的重要因素;而神經(jīng)肽及相關(guān)受體引起的氣道神經(jīng)源性炎癥可能是病毒感染性咳嗽,尤其是感染后咳嗽的關(guān)鍵機(jī)制。 總結(jié)與展望: PIV3和RSV感染均可以制作較為理想的病毒感染咳嗽動(dòng)物模型,兩種模型特征和機(jī)制基本相似,均提示CRS增高并伴隨以SP為主的神經(jīng)肽及受體含量升高和表達(dá)增強(qiáng)為特點(diǎn)的氣道神經(jīng)源性炎癥是病毒感染性咳嗽的重要特征。阻斷神經(jīng)源性炎癥過程,降低CRS,有望成為未來病毒感染性咳嗽一個(gè)主要治療靶點(diǎn)。 第一部分豚鼠副流感病毒感染急性和感染后咳嗽模型的建立 目的: 建立豚鼠PIV3感染急性和感染后咳嗽模型,通過動(dòng)態(tài)觀察感染后豚鼠CRS、AR及氣道炎癥變化,驗(yàn)證模型的成功性。 方法: 1.豚鼠60只,隨機(jī)分成正常對照組,病毒感染組以及哮喘對照組,感染組按病毒感染后天數(shù)又分為6, 12, 28和42天四個(gè)組。每組十只。 2. PIV3經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增并收獲后,通過滴鼻方法接種于實(shí)驗(yàn)豚鼠呼吸道,正常對照組接種細(xì)胞及病毒培養(yǎng)用培養(yǎng)基;哮喘組豚鼠不予接種,而予卵白蛋白致敏和誘發(fā)哮喘。 3.免疫熒光技術(shù)和FQ-PCR方法分別檢測PIV3抗原和核酸。 4.用BUXCO肺功能儀通過辣椒素和乙酰膽堿刺激測定CRS及AR。 5. BALF細(xì)胞學(xué)和肺組織病理學(xué)檢查觀察豚鼠氣道炎癥。 結(jié)果: 1.免疫熒光檢測顯示PIV3感染細(xì)胞和大多數(shù)6及12天組豚鼠肺組織均可見病毒抗原表達(dá)。感染組豚鼠肺組織PIV3 RNA含量在感染后6天組濃度最高,隨著感染后時(shí)間推移呈明顯逐步降低趨勢。 2.不同時(shí)間的病毒感染組豚鼠CRS均較正常對照組(2.50±0.45)明顯升高(P0.05),其中42天組升高(8.40±2.35)最為明顯(P0.01);6天組豚鼠AR對兩個(gè)高濃度MeCh明顯增加(P0.05);哮喘組豚鼠雖然AR對各個(gè)濃度MeCh均明顯升高,但CRS升高無顯著意義。 3. BALF細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示感染和哮喘組豚鼠細(xì)胞總數(shù)均有明顯不同程度的升高,感染后6和第12天組豚鼠淋巴細(xì)胞(Lymph)明顯升高(P0.01);而哮喘組豚鼠嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)顯著高于感染組(P0.001)。 4.肺組織病理學(xué)顯示感染組豚鼠急性期以氣道的炎癥表現(xiàn)為主,隨感染后時(shí)間延長逐漸恢復(fù),未發(fā)現(xiàn)明顯的肺實(shí)質(zhì)炎癥。 結(jié)論: 1.本部分研究制作的PIV3感染豚鼠咳嗽模型中,病毒學(xué)檢查證實(shí)PIV3成功感染。 2.模型豚鼠各時(shí)間組CRS均明顯增高,與URI引起的咳嗽的臨床特點(diǎn)相符。 3. BALF細(xì)胞學(xué)及肺組織病理學(xué)均支持急性期氣道病毒性炎癥改變,而肺實(shí)質(zhì)炎癥不明顯。 以上表明豚鼠PIV3感染急性和感染后咳嗽模型均成功建立,為進(jìn)一步研究病毒感染引起咳嗽的發(fā)病機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 第二部分豚鼠副流感病毒感染咳嗽模型的神經(jīng)源性炎癥機(jī)制探討 目的: 探討PIV3感染豚鼠咳嗽模型CRS增高的機(jī)制及其神經(jīng)源性炎癥在CRS增高及咳嗽發(fā)病中的的作用。 方法: 1.在前文成功建立的PIV3感染豚鼠咳嗽模型基礎(chǔ)上,分別進(jìn)行下列研究: 2. ELISA法檢測豚鼠肺組織勻漿的SP蛋白含量; 3. FQ-PCR方法檢測豚鼠肺組織NK1、VR1的mRNA表達(dá)水平; 4.免疫組化方法檢測豚鼠肺組織SP、VR1、PGP-9.5和NF-200的蛋白表達(dá)及半定量分析; 5.上述神經(jīng)肽蛋白含量、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)各自與CRS的相關(guān)性分析。 結(jié)果: 1.模型豚鼠肺組織勻漿中的SP含量自感染后6天組(31.95±6.35)pg/mg起即有顯著高于對照組(19.5±4.68)并達(dá)到最高峰(P0.01),此后直至感染后42天組(27.12±5.0)均維持在高水平(P0.05)。 2. 12、28和42天組豚鼠肺組織NK1的mRNA水平較對照組明顯上調(diào),于感染后28天組達(dá)到高峰(P0.01),到感染后42天組仍維持高水平。所有感染組VR1的mRNA表達(dá)較對照組均有明顯升高,而在12和28天組升高更為突出(P0.01)。 3.肺組織SP、VR1、PGP-9.5及NF-200蛋白的免疫組化半定量分析結(jié)果: 3.1與對照組相比,感染組SP陽性表達(dá)在感染后6、12及28天組都明顯增強(qiáng)(P0.05),以28天組增強(qiáng)最為明顯(P0.01);而在感染后42天組有所下降,差異已無顯著性。 3.2感染后28和42天組VR1表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)(P0.05)。感染后42天組PGP-9.5表達(dá)較對照組增強(qiáng)(P0.05)。 3.3與對照組相比,感染組NF-200蛋白表達(dá)隨著感染后時(shí)間延長而逐漸增強(qiáng),雖在6和12天組增強(qiáng)無顯著意義,但在28天組的表達(dá)達(dá)最高峰(P0.01),在42天組表達(dá)仍很強(qiáng)(P0.05)。 4.豚鼠CRS與神經(jīng)肽及受體的相關(guān)性分析: 4.1在感染后6和28天組,豚鼠CRS與肺勻漿SP含量呈正相關(guān);在感染后12、28和42天組,豚鼠CRS與NK1mRNA水平呈正相關(guān);各感染組CRS均與VR1mRNA水平呈正相關(guān)。 4.2在感染后6、12和42天組,豚鼠CRS均與SP的蛋白表達(dá)呈正相關(guān);在感染后12和28天組,豚鼠CRS與VR1蛋白表達(dá)呈正相關(guān);在12天組與PGP-9.5表達(dá)顯著正相關(guān);僅在28天組與NF-200表達(dá)有相關(guān)性。 結(jié)論: 1.模型豚鼠SP含量、NK1和VR1mRNA水平明顯升高,多數(shù)SP及部分VR1、PGP-9.5和NF- 200蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),提示引起了神經(jīng)源性炎癥。 2.神經(jīng)肽的變化呈現(xiàn)一定的時(shí)空分布,病毒核酸含量逐步降低,氣道炎癥逐漸恢復(fù);而SP含量仍維持在很高水平,NK1和VR1基因表達(dá)在28天達(dá)到高峰,多數(shù)神經(jīng)肽蛋白在28或42天表達(dá)顯著增強(qiáng)。 3.多數(shù)感染組神經(jīng)肽及受體的含量和表達(dá)與CRS呈正相關(guān),可能是引起后者增高的重要因素。 以上表明,由SP等神經(jīng)肽及相關(guān)受體引起的氣道神經(jīng)源性炎癥,在PIV3感染性咳嗽,尤其是感染后咳嗽發(fā)病機(jī)制中起決定作用。 第三部分豚鼠呼吸道合胞病毒感染咳嗽模型的建立及其神經(jīng)源性炎癥機(jī)制探討 目的: 建立豚鼠RSV感染咳嗽模型,探討RSV感染咳嗽模型神經(jīng)源性炎癥及其在咳嗽發(fā)病中的的作用。 方法: 1.豚鼠40只,隨機(jī)分成RSV感染6, 12, 28和42天組;正常對照組和哮喘對照組同前。接種方法均同前。 2.直接、間接免疫熒光技術(shù)和FQ-PCR方法分別檢測RSV抗原和核酸。 3.用BUXCO肺功能儀測定CRS及AR。豚鼠BALF中細(xì)胞學(xué)和肺組織病理學(xué)檢查觀察氣道炎癥。 4.模型建立成功后,ELISA法檢測豚鼠肺組織勻漿的SP蛋白含量。 5. FQ-PCR方法檢測豚鼠肺組織NK1、VR1的mRNA表達(dá)水平。 6.免疫組化方法檢測豚鼠肺組織SP、VR1及PGP-9.5的蛋白表達(dá)及半定量分析。 7.神經(jīng)肽蛋白含量、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)各自與CRS的相關(guān)性分析。 結(jié)果: 1.免疫熒光檢測顯示RSV感染細(xì)胞和大多數(shù)6及12天組豚鼠肺組織可見病毒抗原表達(dá)。感染組豚鼠肺組織RSV RNA含量在感染后6天組濃度最高,隨著感染后時(shí)間推移明顯呈逐步降低趨勢。 2.從RSV感染開始6天組(8.00±1.22)起,CRS即較正常對照組明顯升高(P0.01),并在12天組(8.70±1.96)達(dá)到最高峰(P0.01),感染后28和42天組(7.60±1.39,6.70±1.17)仍較正常對照組明顯升高(P0.05)。感染后12天組豚鼠AR對兩個(gè)高濃度MeCh刺激有明顯增加(P分別0.05和0.01);而哮喘組豚鼠對每個(gè)MeCh濃度的均有明顯AHR。 3. BALF細(xì)胞學(xué)顯示,感染后6、12和28天組及哮喘組炎癥細(xì)胞總數(shù)均有明顯升高;分類計(jì)數(shù)中,感染后6和12天組Lymph數(shù)明顯升高(P0.05),而哮喘組則以Eos明顯增加為主(P0.05)。肺組織病理學(xué)顯示,感染組在急性期以氣道炎癥表現(xiàn)為主,未見明顯肺實(shí)質(zhì)的炎癥。 4.感染組肺組織勻漿SP含量從6和12天組起即顯著高于對照組(P0.05),在感染后28天組(38.72±14.24)達(dá)到最高峰(P0.01),42天組(37.51±13.43)仍維持在很高水平(P0.01)。 5.感染后12、28和42天組肺組織NK1 mRNA水平均明顯上調(diào)(P0.05)。6、12和28天組VR1 mRNA水平均較對照組明顯上調(diào)(P0.05)。 6.肺組織SP、VR1及PGP-9.5蛋白的免疫組化半定量分析結(jié)果:感染組SP蛋白表達(dá)在感染后12及28天組較正常對照組顯著增強(qiáng)(P0.05)。28天組VR1和12天組PGP-9.5的表達(dá)較對照組顯著增強(qiáng)(P0.05)。 7.豚鼠CRS與神經(jīng)肽及受體的相關(guān)性分析:各感染組肺勻漿SP含量和NK1 mRNA水平均與CRS呈正相關(guān);12和28天組VR1mRNA水平與CRS密切正相關(guān)。CRS與6、12和28天組SP蛋白表達(dá)呈正相關(guān),而與VR1表達(dá)均不相關(guān);6和28天組PGP-9.5與CRS呈正相關(guān)。 結(jié)論: 1.本部分研究制作了豚鼠RSV感染咳嗽模型。病毒學(xué)檢查證實(shí)RSV成功感染豚鼠。各感染組CRS均明顯增高,同URI引起咳嗽的臨床特點(diǎn)一致。BALF細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)檢查支持急性期氣道炎癥改變,而肺實(shí)質(zhì)炎癥不明顯,表明豚鼠RSV感染急性和感染后咳嗽模型成功建立。 2.感染組豚鼠SP含量、NK1和VR1mRNA水平明顯升高,SP、VR1和PGP-9.5蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),提示引起了神經(jīng)源性炎癥;而且它們大多與CRS相關(guān)。CRS和神經(jīng)肽的變化呈現(xiàn)一定的時(shí)空分布特征,病毒核酸含量逐步降低,氣道炎癥逐漸恢復(fù),而CRS、神經(jīng)肽含量及基因表達(dá)卻達(dá)到高峰或仍維持在較高水平,蛋白表達(dá)則多在12和28天顯著增強(qiáng)。表明SP等神經(jīng)肽及相關(guān)受體引起的氣道神經(jīng)源性炎癥是病毒感染性咳嗽,尤其是感染后咳嗽的關(guān)鍵機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R56;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳如沖;劉春麗;羅煒;姚衛(wèi)民;鐘淑卿;賴克方;鐘南山;;感冒后咳嗽敏感性及氣道神經(jīng)源性炎癥改變[J];中國實(shí)用內(nèi)科雜志;2007年09期

2 陳如沖;賴克方;劉春麗;羅煒;鐘南山;;廣州地區(qū)1087名大學(xué)生咳嗽的流行病學(xué)調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;2006年02期

3 陳，

本文編號(hào)：1596594