本文選題：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞　切入點：內(nèi)皮細(xì)胞　出處：《山東大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的: 自兔骨髓中分離獲取高純度的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSC)并對其進行體外培養(yǎng)、擴增;將部分BMSC向內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cells,EC)誘導(dǎo),并鑒別其表型;觀察低氧條件下BMSC及其來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)后,BMSC的增殖情況及體外成骨能力,探討低氧條件下BMSC與其來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)對其體外成骨能力的影響。 方法: 1.兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的分離、培養(yǎng) 利用Percoll分離液(相對密度1.077)進行密度梯度離心法從兔骨髓中分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,進行體外培養(yǎng)擴增。 2.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)和鑒定 采用細(xì)胞性狀穩(wěn)定的第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞消化,吹打均勻,更換培養(yǎng)液為內(nèi)皮誘導(dǎo)培養(yǎng)液,兩三天換液持續(xù)誘導(dǎo),消化傳代后,取細(xì)胞做CD34免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定其內(nèi)皮細(xì)胞表型。 3.MTT法檢測低氧條件下BMSC與其誘導(dǎo)來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞增殖及活力 取第二代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與其誘導(dǎo)來源的內(nèi)皮細(xì)胞,實驗分四組:(1)BMSC常氧培養(yǎng)組;(2)BMSC低氧培養(yǎng)組;(3)BMSC+EC常氧聯(lián)合培養(yǎng)組;(4)BMSC+EC低氧聯(lián)合培養(yǎng)組。體外連續(xù)培養(yǎng)7天,分別在此7天內(nèi)用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖能力,酶標(biāo)儀測定光密度值(OD值),每個樣本設(shè)六個復(fù)孔,求其平均值并繪制細(xì)胞生長曲線。 4.檢測低氧條件下BMSC與其誘導(dǎo)來源的EC聯(lián)合培養(yǎng)的成骨能力 取第三代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與其誘導(dǎo)來源的內(nèi)皮細(xì)胞,實驗分四組:(1)BMSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組;(2)BMSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組;(3)BMSC+EC常氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組;(4)BMSC+EC低氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組。96孔板內(nèi)體外連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6天,分別在此6天內(nèi)用PNPP法檢測各組細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性的表達,酶標(biāo)儀測定光密度值(OD值),每個樣本設(shè)五個復(fù)孔,求其平均值,并繪制ALP活性增長曲線;6孔板內(nèi)四組樣本體外連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天,在第7天行茜素紅染色,觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果: 1.密度梯度離心結(jié)合貼壁獲取高純度的BMSC,且較好保持了細(xì)胞的活性,貼壁3天后細(xì)胞成長梭形及多角形,五六天后增殖迅速,形成細(xì)胞集落。傳代后細(xì)胞形態(tài)更加單一,五六天后即可鋪滿瓶底。 2.由BMSC誘導(dǎo)來源的原代EC培養(yǎng)三天后,細(xì)胞貼壁,五天后明顯集落形成,細(xì)胞成梭形;傳代后,細(xì)胞逐漸變大,由長梭形變?yōu)槎嘟切?成典型的“鋪路石”樣內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。傳代后的內(nèi)皮細(xì)胞CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陽性。 3.MTT法檢測各組細(xì)胞增殖及活力顯示:第一、二天各組細(xì)胞數(shù)量無明顯增加且統(tǒng)計學(xué)上各組間細(xì)胞增殖能力沒有顯著性差異(P＞0.05);第三天后,各組細(xì)胞數(shù)量顯著增加,統(tǒng)計學(xué)上低氧培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖能力均明顯高于常氧培養(yǎng)組(P＜0.01),但同條件下的BMSC單獨培養(yǎng)組和BMSC+EC聯(lián)合培養(yǎng)組間的細(xì)胞增殖能力沒有顯著性差異(P＞0.05)。 4.PNPP法檢測各組ALP活性表達顯示:BMSC+EC低氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組的ALP活性表達明顯高于其他三組(P＜0.05);BMSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組高于BMSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組(P＜0.05);BMSC+EC常氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組高于BMSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組(P＜0.05);四組樣本培養(yǎng)七天后,BMSC+EC低氧成骨誘導(dǎo)聯(lián)合培養(yǎng)組部分細(xì)胞密集生長區(qū)有礦化結(jié)節(jié)形成,茜素紅染色呈橘紅色,其他三組未見。 結(jié)論: 1.BMSC可通過密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)獲得。在一定的體外培養(yǎng)條件下,特性穩(wěn)定,增殖迅速。BMSC在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞。 2.在一定時間內(nèi),低氧培養(yǎng)可以促進BMSC的增殖;BMSC來源的EC不能促進BMSC的增殖。 3.在一定時間內(nèi),低氧培養(yǎng)可增強BMSC的成骨活性;由BMSC來源的EC能夠增強BMSC的成骨活性;低氧條件下,BMSC、EC聯(lián)合培養(yǎng),BMSC的成骨活性可顯著提高。
[Abstract]:Objective:
Since obtaining high purity of isolated rabbit bone marrow stromal stem cells in bone marrow (Bone Marrow Stromal Cells, BMSC) and its in vitro amplification; part of BMSC to endothelial cells (Endothelial Cells EC) induction, and identify the phenotype; the effects of BMSC and its source under hypoxic conditions EC co culture, proliferation and in vitro BMSC osteogenic ability of BMSC under hypoxic conditions and source of EC combined effect of culture on the capacity of osteogenesis in vitro.
Method:
1. isolation and culture of bone marrow stromal cells (BMSC) in rabbits
The density gradient centrifugation was used to separate bone marrow stromal stem cells from rabbit bone marrow by using Percoll separation solution (relative density 1.077).
Induction and differentiation of 2. bone marrow stromal cells to endothelial cells, culture and identification
The second generation of bone marrow stromal cells were stable stem cell digestion, army uniform, the replacement for the endothelial inducing medium cultured for two or three days for liquid continuous induction, after digestion and passage, the cells do CD34 immunocytochemical identification of the phenotype of endothelial cells.
3.MTT assay was used to detect the proliferation and activity of BMSC and its induced EC in hypoxic conditions
The second generation of bone marrow stromal stem cells and induced endothelial cells were divided into four groups: (1) BMSC normoxia group; (2) BMSC hypoxia group; (3) group co cultured in normoxia BMSC+EC group; (4) BMSC+EC co cultured hypoxia. In vitro cultured continuously for 7 days, respectively, in the 7 days was measured by MTT cell proliferation, determination of optical density (OD) eliasa, each sample set up six wells, calculate the average value and drawing the cell growth curve.
4. detection of osteogenesis ability of BMSC and its induced EC under hypoxic condition
The third generation of bone marrow stromal stem cells and induced endothelial cells were divided into four groups: (1) BMSC normoxic osteoblast induced group; (2) BMSC hypoxia induced osteoblast group; (3) BMSC+EC normoxia and osteogenesis co culture group; (4) BMSC+EC hypoxia induced bone lead combined culture group.96 orifice in vitro cultured for 6 days, 6 days respectively in alkaline phosphatase was measured by PNPP cell (ALP) activity expression, determination of optical density (OD) eliasa, each sample set up five wells, calculate the average value, and draw the growth activity of ALP curve; in 6 pore plate four samples of in vitro cultured for 7 days in seventh days, alizarin red staining, observe the formation of mineralized nodules.
Result:
1. density gradient centrifugation combined with adherence to obtain high purity BMSC, and maintained cell viability. After 3 days, cell growth was spindle shaped and polygonal. After five or six days, cell proliferation was rapid, and colony formation was formed. After passages, cell morphology was more single, and five or six days later, it was able to fill the bottom of the bottle.
2. induced by BMSC derived from primary EC after three days of culture, adherent cells, significantly five days after colony formation, spindle cells; after passage, the cells gradually become larger, from fusiform to polygon, a typical cobblestone morphology of endothelial cells. Endothelial cells CD34 immunocytochemistry after passage of the staining was positive.
The proliferation and 3.MTT activity assay showed that the number of first, second days the cells were not significantly increased and statistically between groups of cell proliferation had no significant difference (P > 0.05); third days later, the number of cells in each group increased significantly, statistically hypoxia group cell proliferation were significantly higher than those in normoxia group (P < 0.01), but under the same conditions of BMSC alone to cultivate the ability of joint training group and the proliferation of BMSC+EC cells between groups had no significant difference (P > 0.05).
To detect the activity of ALP 4.PNPP showed that BMSC+EC expression of hypoxia osteogenesis co cultured group ALP activity was significantly higher than the other three groups (P < 0.05); BMSC hypoxia induced osteoblast BMSC group was higher than that of normoxic osteoblast induced group (P < 0.05); normoxia BMSC+EC osteogenic induction group was higher than that of joint training BMSC normoxic osteoblast induced group (P < 0.05); four samples after seven days of culture, BMSC+EC hypoxia osteogenesis cells co culture group dense growth zone mineralized nodule formation, alizarin red staining is orange red, the other three groups were not found.
Conclusion:
1.BMSC can be obtained through density gradient centrifugation combined with adherent culture. Under certain culture conditions,.BMSC is stable and proliferated rapidly. Under certain conditions, it can be induced to differentiate into endothelial cells.
2. during a certain period of time, hypoxia culture can promote the proliferation of BMSC, and the EC derived from BMSC can not promote the proliferation of BMSC.
3., in a certain period of time, hypoxic culture can enhance the osteogenic activity of BMSC. The EC derived from BMSC can enhance the osteogenic activity of BMSC. Under hypoxia, BMSC and EC co culture can significantly enhance the osteogenic activity of BMSC.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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本文編號：1596410