本文選題：協(xié)同刺激分子　切入點：OX40　出處：《蘇州大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： OX40/OX40L是TNFR/TNF家族主要成員,也是免疫應(yīng)答過程中一對重要的協(xié)同刺激分子,他們的相互作用能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖、遷移、并延長其壽命,促進(jìn)記憶性T細(xì)胞的生成,以及刺激生發(fā)中心(GC)的形成和樹突狀細(xì)胞(DCs)的分化成熟。OX40/OX40L還能夠促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的增殖與活化。鑒此,OX40/OX40L途徑在自身免疫性疾病、腫瘤以及移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮極其重要的作用,成為免疫學(xué)研究的熱點課題。同時,OX40/OX40L也成為免疫干預(yù)的靶分子。 本課題研發(fā)了一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的鼠抗人OX40功能性單克隆抗體,并對其生物學(xué)特性展開了初步研究。 一、一株新型鼠抗人OX40單克隆抗體的研制 【目的】鼠抗人OX40分子單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的鑒定。 【方法】以高表達(dá)人OX40分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929-OX40作為免疫原,常規(guī)免疫6~8周齡的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤融合技術(shù),將免疫小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,并以L929-OX40細(xì)胞作為陽性篩選細(xì)胞,以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒的L929-Mock細(xì)胞作為陰性篩選細(xì)胞,采用間接免疫熒光技術(shù)對雜交瘤進(jìn)行反復(fù)篩選以及多次克隆化培養(yǎng),獲得持續(xù)、穩(wěn)定、高效分泌特異性鼠抗人OX40分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;采用快速定性試紙法檢測抗體Ig亞型;利用間接免疫熒光技術(shù)和Western-blot檢測抗體特異性;采用細(xì)胞核染色體技術(shù)對獲得的雜交瘤進(jìn)行核型分析;采用競爭抑制實驗分析抗體的抗原結(jié)合表位;間接免疫熒光技術(shù)分析所獲得單抗對于不同來源人腫瘤細(xì)胞株表面OX40蛋白的識別作用。 【結(jié)果】成功獲得一株穩(wěn)定、高效分泌鼠抗人OX40分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為9H8。雜交瘤細(xì)胞核型分析結(jié)果顯示,雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)目在80條以上,超過小鼠B細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù),表明其為融合細(xì)胞;快速定性試紙法檢測結(jié)果顯示,單抗9H8的重鏈為IgG1型,輕鏈則為к鏈;Western-blot以及間接免疫熒光分析結(jié)果顯示,單抗9H8能夠特異性識別OX40分子,結(jié)果與商品化抗體ACT-35相一致;抗體競爭抑制實驗結(jié)果表明,單抗9H8與本科室業(yè)已獲得的單抗1F7以及商品化單抗ACT-35識別不同的抗原表位;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,單抗9H8能夠識別經(jīng)激發(fā)型CD3單抗活化的人T細(xì)胞上OX40分子的表達(dá),并且能夠識別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG-44, SF-295,人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,人肺癌細(xì)胞株H460,人宮頸癌細(xì)胞株HELA, SIHA,人腸癌細(xì)胞株CW-2, LS-174T,人視網(wǎng)膜神經(jīng)母細(xì)胞株Y79以及人白血病細(xì)胞株U937, U266, Jurkat表面的OX40分子表達(dá)。 【結(jié)論】成功獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人OX40分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,該單抗與已經(jīng)獲得的OX40分子單抗識別完全不同的抗原表位,為進(jìn)一步研究OX40分子ELISA快速檢測試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。單抗的研制成功也為進(jìn)一步研究OX40/OX40L信號通路提供了有力工具。 二、鼠抗人OX40單克隆抗體對T細(xì)胞的體外協(xié)同刺激作用 【目的】利用所獲得的鼠抗人OX40單克隆抗體,研究OX40信號激發(fā)人T細(xì)胞的體外活化和增殖等方面的作用。 【方法】激發(fā)型CD3單抗包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,體外培養(yǎng)人T細(xì)胞,并且加入不同濃度的鼠抗人OX40單抗,MTT法檢測單抗對T細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,并收集培養(yǎng)上清,ELISA法檢測細(xì)胞因子的分泌水平;免疫熒光技術(shù)分別檢測CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞表面CD25表達(dá)。 【結(jié)果】結(jié)果顯示,無需CD28信號的協(xié)同刺激,所獲得的OX40單抗就能夠有效地促進(jìn)T細(xì)胞體外大量增殖,并且促進(jìn)其細(xì)胞因子的分泌( IFN-γ,IL-10, TGF-β),上調(diào)CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞表面CD25的表達(dá)。由此表明,研制的抗人OX40單抗是一株具有激發(fā)作用的功能性抗體。 【結(jié)論】成功研制一株鼠抗人OX40激發(fā)型單克隆抗體,能夠在體外促進(jìn)經(jīng)CD3活化T細(xì)胞的有效增殖,以及細(xì)胞因子的分泌;同時對于促進(jìn)CD4+ T細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞的活化、維持其活化時間以及長期存活都具有明顯的協(xié)同刺激作用。這為體外大量擴(kuò)增效應(yīng)性T細(xì)胞提供了有效的手段,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 居頌文,劉琳,居頌光,於葛華,潘建忠,邱玉華,張學(xué)光;鼠抗人CD28功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的鑒定[J];上海免疫學(xué)雜志;2003年05期

2 孫建軍,施勤,王勤,朱一蓓,陳潔,陳永井,張學(xué)光;人OX40轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的建立及其對樹突狀細(xì)胞的促分化作用[J];上海免疫學(xué)雜志;2003年06期

3 邱玉華，張學(xué)光，謝煒，朱學(xué)東;一種顯著提高小鼠生產(chǎn)單抗腹水產(chǎn)量的新方法[J];中國免疫學(xué)雜志;1995年06期

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本文編號：1591038