本文選題：融合　切入點：融合細胞　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)體細胞在體外被誘導(dǎo)通過融合可以被病毒感染的現(xiàn)象后,關(guān)于細胞間融合的研究便迅速展開并不斷深入。目前,由病毒或化學(xué)方法介導(dǎo)的細胞間融合已成為基因表達分析、染色體圖譜、抗體生產(chǎn)及癌癥免疫治療的有力工具之一。細胞融合在個體發(fā)育、疾病發(fā)生和治療等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用,如受精、肌肉、骨骼和胎盤的發(fā)育,以及由干細胞調(diào)控的組織再生等過程中無不突顯它的身影。 細胞間融合被認為是干細胞作用于組織再生過程的一種重要機制。諸如肝、肌肉、骨和軟骨等組織在損傷后可以重建,機體接受損傷信號后,損傷部位本身的或遷移入損傷部位的干細胞經(jīng)過增殖和分化后完成組織重建。然而,這種關(guān)于重建的理解并不能解釋發(fā)育過程中干細胞或它們的后代是如何遷至機體最合適部位的?但是,如果是因為干細胞與該組織的實質(zhì)細胞發(fā)生了融合,就可以解釋上述問題。融合已被證明是作用于組織再生的一種重要機制。融合后的細胞可以擴增和分裂,修飾后的雜合細胞將成為再生醫(yī)學(xué)和細胞移植療法的又一新的種子細胞。然而人們對細胞融合過程的了解甚少。在損傷環(huán)境中,融合細胞是如何發(fā)揮作用的?融合細胞作用的機制是什么?融合細胞在特定的環(huán)境中會怎樣發(fā)生變化?目前還尚未見相關(guān)研究的報道。因此,本研究將胚胎干細胞參與形成的融合細胞作為研究對象,探討融合細胞在損傷微環(huán)境中的作用與變化情況。 重序論是現(xiàn)今被廣泛認可的干細胞作用于組織重建機制的一種學(xué)說。通過將體細胞與胚胎源性細胞融合,或通過轉(zhuǎn)導(dǎo)幾種多能性相關(guān)的關(guān)鍵因子,體細胞的基因組可以被重序。干細胞與分化終末細胞的融合可以重序終末分化細胞的DNA,從而可以調(diào)控終末分化細胞的潛能和細胞命運。當(dāng)異核體形成或“合子”形成后,染色體發(fā)生混合(非同源重組)或受到來源于干細胞的細胞因子(包括轉(zhuǎn)錄因子)作用后,終末分化細胞的DNA可以發(fā)生重序�？梢�,“合子”的形成會使細胞具有“多能化”的特性從而直接改變其表型。體外實驗證明,異核體具有遺傳重序的潛能,形成的雜合細胞擁有多能性,與ES細胞的特征相似。因此,基于以上理論,本研究假設(shè),融合后的重編程化的細胞在損傷微環(huán)境中,以干細胞的方式作用于組織再生與損傷修復(fù)是融合細胞的作用機理。 本研究首先建立了體外損傷細胞模型。試驗使用氧化損傷劑H202對人胎肝細胞系L-02細胞進行了損傷。如果損傷過于嚴重,細胞將大量死亡使后繼試驗無法進行。如果損傷達不到一定程度,細胞自身有修復(fù)功能,那么細胞將在短時間內(nèi)自我修復(fù),這也將影響到后繼試驗的進行和試驗結(jié)果的分析。因此,損傷模型的建立進行了多濃度、多時間點的摸索與比較,以篩選到適合的損傷條件。通過分析損傷后細胞的活力、損傷相關(guān)酶的分泌及功能性蛋白的分泌,制備了H202作用于L-02細胞的時效量效曲線。最后選擇C3=200μM處理2小時為最適損傷濃度和損傷時間,并將其作為最佳損傷條件,建立了L-02細胞的體外損傷模型。 融合在組織損傷修復(fù)過程中的作用,其中爭論最多的是融合發(fā)生率問題,很多研究人員都以融合的偶發(fā)率作為駁斥融合理論的證據(jù)。但是到目前為止,對融合率的確定都是建立在分析特異性標志物的基礎(chǔ)上,比如用FISH技術(shù)和鑒定Y染色體存在等方法。但是這些檢測方法的“丟失率”很高。因此,在本實驗中我們將ES細胞與轉(zhuǎn)GOF-18質(zhì)粒的損傷體細胞共培養(yǎng)后,用最直接的核型分析方法檢測損傷微環(huán)境中融合的發(fā)生率。共培養(yǎng)48小時后,在統(tǒng)計細胞總數(shù)及非整倍體細胞中染色體數(shù)目后發(fā)現(xiàn),在ES細胞與損傷肝細胞共培養(yǎng)體系中非整倍體的發(fā)生率比正常對照組高出近12倍。通過核型分析和熒光檢測發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)系統(tǒng)中的非整倍體細胞為兩種親本細胞的融合產(chǎn)物。同時,與對照組相比,損傷相關(guān)酶活性檢測的結(jié)果也顯示：共培養(yǎng)以后損傷被明顯地抑制了。通過基因表達及蛋白表達分析發(fā)現(xiàn),ES細胞在共培養(yǎng)以后分化成了肝細胞特性細胞。以上結(jié)果均說明將ES細胞與損傷的肝細胞直接共培養(yǎng)以后產(chǎn)生了非整倍體的融合細胞,損傷被修復(fù)。融合的發(fā)生率比以往報道的發(fā)生率要高。這暗示了融合在一定程度上對組織的損傷修復(fù)是有作用的。本試驗中還有一個比較重要的發(fā)現(xiàn),ES細胞在與損傷的肝細胞共培養(yǎng)以后,分化成了肝細胞特性的功能性肝上皮細胞,這為ES細胞的體外定向分化又提供了一種新的方法。同時提示是否分化為組織特異性細胞是重序的融合細胞作用于組織修復(fù)的一種方式,因為由ES細胞產(chǎn)生的重序的融合細胞也是多能性的。 在證明共培養(yǎng)有利于損傷修復(fù)和確定了融合在細胞損傷修復(fù)過程中的重要作用以后,為了更深入地研究融合細胞如何在損傷細胞與ES細胞的共培養(yǎng)過程中發(fā)揮作用,本試驗進一步用PEG誘導(dǎo)的方法,獲得了人源轉(zhuǎn)GOF-18質(zhì)粒的肝細胞與小鼠源ES細胞的融合細胞,并運用多種方法,對融合細胞進行融合鑒定及重序鑒定。篩選得到的融合細胞中,有85%以上的細胞表達了EGFP,證明了融合細胞的形成。 融合細胞在器官形成、組織再生和癌形成中都有重要的作用。但是對融合細胞的命運及功能的研究還很少。因此,基于以上的試驗結(jié)果,試驗計劃在體外的損傷微環(huán)境中研究了融合細胞的命運和功能。有眾多的研究都報道來源于多能性細胞和體細胞的融合細胞中,體細胞的基因組會被重序,它們的融合產(chǎn)物具有與胚胎干細胞一樣的多能性,因此本研究假設(shè),融合細胞在損傷環(huán)境中,會像ES細胞一樣發(fā)揮作用�；谏鲜龅脑囼灲Y(jié)果,試驗將獲得的融合細胞與損傷的肝細胞用transwell進行共培養(yǎng)。試驗用Annexin-V/PI雙染色法、FACS和Western-blot方法對損傷細胞進行了損傷細胞的凋亡狀況分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在整個p53相關(guān)的凋亡通路中,隨著共培養(yǎng)的進行,凋亡促進因子(p53, Bax, BC1-2, caspase-3)呈現(xiàn)級聯(lián)式的下調(diào),其中,Bax的表達變化最為顯著。通過RT-PCR分析,試驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的Bax在抑制凋亡的過程中起主要作用。與對照組相比,信號通路中的其它因子雖有變化但不明顯。這說明在共培養(yǎng)過程中,Bax對凋亡抑制作用是非常重要的。試驗證明共培養(yǎng)以后,H202誘導(dǎo)肝細胞的損傷通過抑制細胞凋亡的方式被修復(fù)了。,通過與融合細胞的共培養(yǎng),L-02細胞的凋亡被有效地抑制了,凋亡的抑制可能與Bax相關(guān)信號通路相關(guān)。通過分析基因表達模式和蛋白表達方式,結(jié)果顯示融合細胞分化成了肝上皮細胞樣細胞,具有分泌功能的肝細胞特性。分化后的融合細胞呈AFP、ALB(肝細胞標記)和CK818(上皮細胞標記)陽性。而且融合細胞中重新表達有轉(zhuǎn)錄活性的肝臟特異性的基因不僅有人源的也有小鼠源性的,這證實了本研究的假設(shè)：融合細胞可以像ES細胞一樣發(fā)揮功能,融合細胞具有雙向分化的能力。近期相繼的研究都報道了將體細胞與干細胞融合后,融合細胞會重序為“干細胞樣”細胞,甚至轉(zhuǎn)導(dǎo)入幾種關(guān)鍵性因子后體細胞都能在體外被重序為“胚胎干細胞樣”細胞。本試驗用免疫熒光的方法,再次證實了融合細胞定向地分化成了肝上皮細胞。另外,在分析損傷相關(guān)的酶的活性及肝功能蛋白的分泌后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,這些酶的活性逐漸趨向于正常的肝細胞的分泌量。ALB分泌的持續(xù)增加再次證明了分化的融合細胞為功能性的肝細胞。本試驗證明特定的條件下(共培養(yǎng)),重序后的融合細胞有分化成組織特異性細胞的能力,就像ES細胞的定向分化能力一樣。 在建立了體外細胞氧化損傷模型后,本研究首先通過共培養(yǎng)ES細胞與損傷細胞來分析融合在損傷微環(huán)境中的發(fā)生情況及其作用。在確定了融合對損傷的修復(fù)作用后,試驗進一步對融合細胞在共培養(yǎng)環(huán)境中的命運和功能進行了分析。結(jié)果表明,在損傷的微環(huán)境中,融合細胞會像多能性胚胎干細胞一樣分化成肝上皮細胞樣細胞,抑制損傷細胞的凋亡,促進細胞增殖并修復(fù)損傷。 本試驗首次將融合細胞直接用于損傷修復(fù)的研究中,并首次在損傷微環(huán)境中對融合細胞命運及功能進行了體外的檢測和分析。試驗同時還提供了一種胚胎干細胞定向分化的新方法。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：1589840