本文選題：心臟祖細胞　切入點：起搏細胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 1.研究目的和背景 種子細胞是組織工程化組織、器官構(gòu)建,干細胞移植的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。心血管領(lǐng)域目前研究應(yīng)用的種子細胞,以胚胎干細胞(ESC)和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)為主,但前者誘導(dǎo)分化條件復(fù)雜、易于成瘤,后者屬于成體干細胞的范疇,壽命有限、活力較差;且作為自體來源的細胞,BMSC必須在發(fā)現(xiàn)病例后才可進行繁瑣的體外細胞培養(yǎng)、擴增,其時效性和有限的生長潛能限制了臨床的廣泛應(yīng)用。此外,已有的研究均表明上述兩種細胞誘導(dǎo)分化為心血管細胞的比率較低,因此,都不是理想的種子細胞。尋找適宜的種子細胞是開展心血管組織工程、和干細胞移植治療心血管疾患必須解決的首要問題。 從理論上推測,胚胎心臟干/祖細胞發(fā)育時序上更接近心臟的組織細胞,且具有較強的分化增殖能力,因而,誘導(dǎo)分化為心臟的組織細胞更容易。近來研究較多的心臟干/祖細胞主要有三種來源,分別是早期胚胎心臟或心管、成體心臟、ESC所形成類胚體中的心臟原基。后兩者來源的心臟干/祖細胞其分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究已有較多報道,而從早期胚胎心管分離培養(yǎng)的心臟干/祖細胞生物學(xué)特性的研究目前則尚未見報道。從心臟發(fā)育的角度粗略講,早期胚胎心管中存在心肌源性祖細胞和心內(nèi)膜源性的祖細胞,前者構(gòu)成了心臟的絕大部分,最終形成各種類型的心肌細胞和傳導(dǎo)細胞;后者在心臟中只占很小一部分,最終分化形成心內(nèi)膜、瓣膜、隔膜等組織。本課題擬對胚胎心臟祖細胞的生物學(xué)特性進行深入研究,以便為心臟組織工程、細胞移植治療心肌梗死、生物心臟起搏器的構(gòu)建等研究尋找一種理想的新型種子細胞。 2.材料和方法 2.1人胚胎心臟祖細胞的生物學(xué)特性 2.1.1細胞培養(yǎng)和鑒定 2.1.1.1胚胎心臟祖細胞的培養(yǎng) 取4周胚齡的藥物流產(chǎn)人胚胎,在解剖顯微鏡下分離心管,將心管在0.25%胰酶中消化分散為單細胞懸液;上述得到的單細胞懸液離心并去上清,使用含15%胎牛血清、0.375%碳酸氫鈉、10ug/L VEGF、10~6U/L LIF、10~6U/L青霉素、10~6U/L鏈霉素、2mmol/L谷安酰氨的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸;將重懸的單細胞懸液接種于六孔細胞培養(yǎng)板或者十二孔細胞培養(yǎng)板,細胞長滿后進行傳代擴增。 2.1.1.2胚胎心臟祖細胞的鑒定 人胚胎心臟祖細胞的鑒定包括:①形態(tài)學(xué)的觀察;②采用免疫熒光的方法檢測Nkx2.5、Isl-1分子標志物的表達;③采用免疫細胞化學(xué)的方法檢測平滑肌肌動蛋白、細胞角蛋白、Ⅷ因子,C-kit的表達;④RT-PCR檢測GATA-4(心臟特異轉(zhuǎn)錄因子)的表達。 2.1.2胚胎心臟祖細胞的生物學(xué)特性 2.1.2.1胚胎心臟祖細胞的基本生物學(xué)特性 通過倒置相差顯微鏡和透射電鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學(xué)特征;通過生長曲線和分裂指數(shù)曲線的繪制檢測細胞的生長特性。 2.1.2.2胚胎心臟祖細胞的分化特性 2.1.2.2.1向心肌細胞的誘導(dǎo)分化 利用5-氮胞苷誘導(dǎo)第15代胚胎心臟祖細胞向心肌細胞的分化,分別在誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后10天、15天三個時相RT-PCR檢測心肌源性特異基因GATA-4、α-MHC的表達,免疫熒光細胞化學(xué)的方法檢測心肌肌動蛋白的表達,倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的改變,Western Blot的方法檢測誘導(dǎo)前后細胞心肌肌動蛋白的表達。 2.1.2.2.2向平滑肌細胞的誘導(dǎo)分化 與家犬血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎心臟祖細胞向平滑肌細胞方向分化,對誘導(dǎo)前后的細胞免疫熒光檢測α-SMA和MHC-sm的表達,Western Blot的方法檢測誘導(dǎo)前后細胞α-SMA的表達。 2.2胚胎心臟祖細胞向心臟起搏細胞的誘導(dǎo)分化 2.2.1大鼠胚胎心臟祖細胞的培養(yǎng) 250g雌雄SD大鼠配對合籠喂養(yǎng),第二天觀察糞盤是否有陰栓,確定雌鼠受孕開始時間;于受孕后10.5天斷頸處死母鼠,取出子宮在無菌PBS中洗滌,用鑷子撕開子宮和羊膜,分離得到心管;將心管在0.25%胰酶中消化分散為單細胞懸液后,采用與人胚胎心臟祖細胞相同的操作接種、培養(yǎng)、傳代擴增大鼠胚胎心臟祖細胞。 2.2.2大鼠胚胎心臟祖細胞的鑒定 大鼠胚胎心臟祖細胞的鑒定包括:①形態(tài)學(xué)的觀察鑒定;②采用免疫熒光的方法檢測原代、第5代、第20代細胞Nkx2.5分子標志物的表達;③采用免疫熒光的方法檢測原代、第5代、第20代細胞OCT-4分子標志物的表達;④采用免疫熒光的方法檢測原代、第5代、第20代細胞階段特異性胚胎抗原SSEA-4分子的表達。 2.2.3大鼠胚胎心臟祖細胞向起搏細胞的誘導(dǎo)分化 胚胎心臟祖細胞接種培養(yǎng)兩天后,更換培養(yǎng)基為含有內(nèi)皮素—1的DMEM,送孵箱進行誘導(dǎo)培養(yǎng),三天后換回正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細胞的搏動情況并錄像。誘導(dǎo)前后的細胞通過免疫熒光的方法檢測HCN2、HCN4、Connexin43、Connexin45、心肌肌動蛋白、Nkx2.5、OCT—4的表達,通過HE染色和電鏡觀察檢測其形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變,通過膜片鉗技術(shù)檢測其電生理情況。 3.結(jié)果 3.1人胚胎心臟祖細胞的生物學(xué)特性 3.1.1生長情況和鑒定 原代培養(yǎng)的人胚胎心臟祖細胞接種后六個小時貼壁生長,4-8天后融合生長,鏡下主要呈圓形、長梭形、三角形,傳代后的胚胎心臟祖細胞呈長梭形、三角形、和少量圓形;原代和傳代的細胞免疫熒光染色Nkx2.5、Isl-1呈陽性,免疫細胞化學(xué)染色平滑肌肌動蛋白、細胞角蛋白、Ⅷ因子、C-kit呈陰性;GATA-4mRNA的表達高于對照組胚胎肢芽間充質(zhì)細胞。 3.1.2胚胎心臟祖細胞的生物學(xué)特性 3.1.2.1胚胎心臟祖細胞基本生物學(xué)特性 第八代細胞透射電鏡顯示典型的幼稚細胞亞微結(jié)構(gòu)特征;生長曲線和分裂指數(shù)曲線顯示細胞生長迅速擴增能力強,并計算出群體倍增時間約為56個小時;目前細胞已傳至20代并能在體外活躍增殖。 3.1.2.2胚胎心臟祖細胞的分化特性 3.1.2.2.1向為心肌細胞的誘導(dǎo)分化 5-氮胞苷處理后,經(jīng)RT-PCR檢測α-MHC、GATA-4的表達隨著誘導(dǎo)時程的延長而增高,心肌肌動蛋白的免疫熒光染色在誘導(dǎo)后變?yōu)殛栃?Western Blot檢測心肌肌動蛋白的表達也隨著誘導(dǎo)增高,誘導(dǎo)后細胞的形態(tài)亦發(fā)生了明顯的改變,出現(xiàn)了典型的肌節(jié)和閏盤結(jié)構(gòu)。 3.1.2.2.2向平滑肌細胞的誘導(dǎo)分化 胚胎心臟祖細胞與家犬內(nèi)皮細胞混合共培養(yǎng)誘導(dǎo)后,α-SMA免疫熒光染色變?yōu)闉殛栃?Western Blot檢測其表達亦隨著誘導(dǎo)的進行而增高,但未檢測到MHC-sm的表達。 3.2胚胎心臟祖細胞向心臟起搏細胞的誘導(dǎo)分化 3.2.1大鼠胚胎心臟祖細胞生長情況及鑒定 原代培養(yǎng)的大鼠胚胎心臟祖細胞生長情況和基本形態(tài)與上述人的細胞類似,分子標志物鑒定原代、第5代、第20代細胞Nkx2.5、OCT-4為陽性,SSEA-4為陰性。 3.2.2向心臟起搏細胞的誘導(dǎo)分化 胚胎心臟祖細胞誘導(dǎo)前觀察較少見單個細胞的搏動,融合生長后僅見局部細胞團簇的搏動,經(jīng)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)4天后可見大量單個細胞的搏動,融合生長后成同步性收縮;誘導(dǎo)前后細胞的基本形狀HE染色觀察無明顯變化,但誘導(dǎo)后出現(xiàn)少量的線粒體、尚不發(fā)達的高爾基體和較不完整的肌絲樣結(jié)構(gòu),細胞之間可見有連接樣的結(jié)構(gòu)增多,總體看仍為幼稚型細胞結(jié)構(gòu)。 胚胎心臟祖細胞經(jīng)過內(nèi)皮素—1誘導(dǎo)后,利用膜片鉗技術(shù)檢測單細胞動作電位,結(jié)果表明所檢測細胞均出現(xiàn)自發(fā)放電現(xiàn)象,其中大量細胞產(chǎn)生了起搏動作電位。在誘導(dǎo)前的胚胎心臟祖細胞中,免疫熒光檢測縫隙連接蛋白43、縫隙連接蛋白45、HCN2、HCN4、心肌肌動蛋白的表達是成陰性的;在細胞經(jīng)過誘導(dǎo)后,五種蛋白的表達由陰性變?yōu)榱岁栃?Nkx2.5、OCT-4在誘導(dǎo)前細胞中成陽性表達,隨著誘導(dǎo)的進行,表達無明顯變化。 4.討論 4.1胚胎心臟祖細胞的鑒定 在早期胚胎中,心臟是最早形成的組織器官之一。早在胚胎管狀心臟形成之初,主要存在兩類心臟的祖細胞譜系;一是心肌層細胞譜系,另一類是心內(nèi)膜細胞譜系。其中前者構(gòu)成了心臟的絕大部分,最終形成各種類型的心肌細胞和傳導(dǎo)細胞。后者在心臟中只占很小一部分,最終分化形成心內(nèi)膜、瓣膜、隔膜等組織。在本研究中培養(yǎng)的胚胎心臟祖細胞分離自胚胎心管形成之初,主要以心肌源性祖細胞為主;該細胞經(jīng)檢測表達心臟早期祖細胞的特異轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5,這與Hidaka等從鼠ES細胞形成的類胚體中分離培養(yǎng)的心臟祖細胞類似,提示本研究中分離培養(yǎng)的胚胎心臟祖細胞具有分化為各種類型心肌細胞的潛力。 除了Nkx2.5之外,對于人胚胎心臟祖細胞,尚進行了C-kit和Isl-1心臟干/祖細胞分子標志物檢測鑒定,結(jié)果顯示Isl-1是陽性的,這與國外學(xué)者Cai等的研究結(jié)果類似。α-SMA、CK、Ⅷ因子的免疫細胞化學(xué)檢測為陰性,表明該細胞群中不存在成熟肌細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞等不同類型的成熟雜細胞。 OCT—4是胚胎早期發(fā)育的一個關(guān)鍵基因,一般作為具有多向分化潛能的細胞的標記物,在大鼠胚胎心臟祖細胞鑒定中,OCT—4的陽性進一步說明了該細胞的多向分化潛能。SSEA—4是階段特異性胚胎抗原,其與早期胚胎發(fā)育全能性細胞之間的識別和相互作用有關(guān),大鼠胚胎心臟祖細胞分離自早期胚胎心管,該細胞在發(fā)育時序上已經(jīng)向特定組織的祖細胞方向分化,故SSEA-4的表達是陰性的。 4.2胚胎心臟祖細胞的分化潛能和其他生物學(xué)特性 4.2.1胚胎心臟祖細胞基本生物學(xué)特性 未分化的幼稚型細胞一般具備如下形態(tài)結(jié)構(gòu)特征:細胞體積小,核大胞漿少,有一個或幾個核仁,常染色質(zhì)多,異染色質(zhì)少,胞漿細胞器少而簡單,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多,游離核糖體密集有序排列等。本實驗培養(yǎng)的胚胎心臟祖細胞細胞超微結(jié)構(gòu)觀察顯示:細胞核大,為圓形或橢圓形,核內(nèi)常染色質(zhì)區(qū)域大,異染色質(zhì)區(qū)域小,除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體外基本上無其他胞漿細胞器,具有較為幼稚的細胞結(jié)構(gòu)特點。生長曲線和分裂指數(shù)曲線亦顯示該細胞生長迅速,擴增能力強,符合原始幼稚細胞的特點。 4.2.2胚胎心臟祖細胞的分化特性 4.2.2.1胚胎心臟祖細胞向心肌細胞分化的潛能 5—氮胞苷是目前常用的誘導(dǎo)干細胞向心肌細胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑,MSCs、臍血間充質(zhì)干細胞和成體心臟干細胞均可被一定劑量的5—氮胞苷誘導(dǎo)為心肌細胞。本實驗利用5—氮胞苷誘導(dǎo)人胚胎心臟祖細胞后,細胞形態(tài)發(fā)生了改變;橫紋肌肌動蛋白免疫熒光檢測由陰性變?yōu)殛栃?Western Blot檢測表達明顯升高:RT-PCR檢測心肌特異分子標志物心肌肌球蛋白重鏈、GATA—4的表達升高;超微結(jié)構(gòu)觀察出現(xiàn)了肌節(jié)和閏盤的結(jié)構(gòu);證明胚胎心臟祖細胞已經(jīng)被誘導(dǎo)為心肌樣細胞。上述研究結(jié)果提示,來源于人胚胎心管的心臟祖細胞有潛力分化為成熟心肌細胞。 4.2.2.2胚胎心臟祖細胞向平滑肌分化的潛能 在本實驗的研究當中,采用與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)胚胎心臟祖細胞向平滑肌方向分化,檢測誘導(dǎo)后的胚胎心臟祖細胞平滑肌肌動蛋白免疫熒光細胞化學(xué)染色由陰性變?yōu)殛栃?Western Blot檢測其表達亦隨著誘導(dǎo)的進行而增高,表明已向平滑肌方向發(fā)生轉(zhuǎn)化;但在實驗中未檢測到平滑肌肌球蛋白重鏈的表達,表明胚胎心臟祖細胞完全轉(zhuǎn)化為平滑肌細胞尚需進一步的誘導(dǎo)。 4.3胚胎心臟祖細胞向心臟起搏細胞分化的潛能 目前生物心臟起搏器構(gòu)建的研究十分活躍,利用細胞的方法構(gòu)建生物心臟起搏器是將具有起博活性的細胞移植到心臟,代替和修復(fù)宿主缺損的起博細胞,達到重新恢復(fù)心臟正常起搏能力的目的。本研究在明確了人胚胎心臟祖細胞的基本生物學(xué)特性和分化特性后,欲進一步檢測其構(gòu)建生物心臟起搏器和向心臟起搏細胞方向分化的可能性。 人胚胎心臟祖細胞移植到動物心臟進行構(gòu)建生物心臟起搏器的實驗研究中,存在異種間免疫反應(yīng)的問題,雖然可以考慮施用免疫抑制劑,但對于竇房結(jié)毀損的動物模型而言,無疑極大的增加了實驗動物的死亡率。此外,人類和實驗動物心臟起搏細胞的起搏節(jié)律并不一致,所以不宜直接利用人胚胎心臟祖細胞進行構(gòu)建生物心臟起搏器的動物實驗研究。為了檢測胚胎心臟祖細胞向起搏細胞分化的潛能及方便利用其進行構(gòu)建生物心臟起搏器的動物實驗研究,我們從與人四周齡胚胎同期的大鼠胚胎心管中分離培養(yǎng)了胚胎心臟祖細胞,并對其進行了向心臟起搏細胞方向的誘導(dǎo)分化。 心臟中起搏細胞早期發(fā)育分化的過程和機理目前知之甚少,最初的研究顯示胚胎早期心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)是通過接受到某種旁分泌信號,開始募集周圍的多潛能心肌細胞(心臟祖細胞)形成的。隨后的研究表明內(nèi)皮—肌信號在這個過程中起到了關(guān)鍵的作用,鄰近內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮素—1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白—1等旁分泌因子誘導(dǎo)周圍的心臟祖細胞募集并向傳導(dǎo)系統(tǒng)組織細胞轉(zhuǎn)變,這一結(jié)果在體外培養(yǎng)的細胞模型(胚胎干細胞來源的心肌細胞)中也得到了證實。提示內(nèi)皮素—1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白—1等旁分泌因子可以促使原始心肌細胞(心臟祖細胞)轉(zhuǎn)變?yōu)槠鸩毎?在本研究中,胚胎心臟祖細胞經(jīng)內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)五天后,光鏡下直接觀察或HE染色觀察其基本形狀與誘導(dǎo)前相比無明顯改變;但透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)證實誘導(dǎo)后細胞有了較為明顯的分化;證據(jù)之一是誘導(dǎo)后出現(xiàn)較誘導(dǎo)前為多的簡單細胞器結(jié)構(gòu),包括少量的線粒體、尚不發(fā)達的高爾基體和較不完整的肌絲樣結(jié)構(gòu),證據(jù)之二是誘導(dǎo)后細胞之間可見有連接樣的結(jié)構(gòu)增多。這一超微結(jié)構(gòu)上的變化在免疫熒光染色上得到了進一步的證實,心肌肌動蛋白(細肌絲的主要組成成分)的染色在誘導(dǎo)前后由陰性變?yōu)榱岁栃?縫隙連接蛋白43和45在誘導(dǎo)后也出現(xiàn)了多量的表達。肌動蛋白的表達或肌絲樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)是誘導(dǎo)后細胞搏動更為明顯的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而縫隙連接蛋白的表達則表明誘導(dǎo)后細胞之間更易建立肌電偶聯(lián)。總之,搏動情況和形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化為誘導(dǎo)后細胞已經(jīng)向起搏細胞方向發(fā)生轉(zhuǎn)變給出了初步的證據(jù)。 起搏細胞之所以具有自動興奮性,是由于在動作電位四期激活產(chǎn)生一種稱為If的內(nèi)向離子流,導(dǎo)致了細胞的自動除極。編碼If離子流的通道分子稱為超級化激活的環(huán)核苷酸門控的離子通道(hyperpolarization-activated cyclicnucleotide-gated channel,HCN),由于HCN與心臟起搏的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)關(guān)系密切,所以被稱為起搏基因。在本研究中,我們通過免疫熒光染色和RT-PCR檢測了誘導(dǎo)后細胞起搏基因HCN2和HCN4的表達,結(jié)果證明了誘導(dǎo)后細胞存在上述兩種起搏離子通道,具備了起搏細胞產(chǎn)生自動興奮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。進一步我們利用單細胞膜片鉗實驗檢測誘導(dǎo)后胚胎心臟祖細胞的電生理情況,顯示誘導(dǎo)后細胞出現(xiàn)了連續(xù)的自發(fā)性動作電位(竇房結(jié)樣起搏動作電位和心房肌樣起搏動作電位),這一結(jié)果最終證明了誘導(dǎo)后細胞可以自發(fā)產(chǎn)生起搏動作電位(自動興奮性),具備了起搏細胞最基本的電生理特征。 5.結(jié)論 人早期胚胎心管來源的心臟祖細胞具有幼稚型的細胞結(jié)構(gòu)和旺盛的生長特性,誘導(dǎo)分化為心肌樣細胞和平滑肌樣細胞的誘導(dǎo)率高、誘導(dǎo)分化條件簡單,是心血管組織工程和干細胞移植研究較理想的種子細胞。 大鼠胚胎心管來源的胚胎心臟祖細胞易于分離、培養(yǎng)、擴增,利用內(nèi)皮素-1可將其誘導(dǎo)成為具有穩(wěn)定起搏活性的心臟起搏細胞,是生物心臟起搏器構(gòu)建較理想的細胞來源。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：1589279