本文選題：慢病毒　切入點(diǎn)：HIV-1　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:研究人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)病毒蛋白R(shí)(viral protein R,Vpr)對(duì)卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)裂解性周期復(fù)制的影響,并對(duì)此過(guò)程所涉及到的信號(hào)通路進(jìn)行鑒定。 方法:1、包裝和鑒定含Vpr基因的重組慢病毒,并進(jìn)行滴度測(cè)定。以重組慢病毒Vpr感染原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞系【primary effusion lymphoma,PEL,又稱體腔淋巴瘤(body cavity-based lymphoma,BCBL)】來(lái)源的BCBL-1細(xì)胞,反轉(zhuǎn)錄RCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和免疫印跡(Western blot)分別檢測(cè)Vpr基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。2、用病毒感染方法將Vpr基因?qū)隤EL細(xì)胞系,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR)、RT-PCR和Western blot檢測(cè)KSHV裂解期基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá);進(jìn)一步檢測(cè)感染后細(xì)胞上清中KSHV病毒含量,并以RT-PCR和Western blot檢測(cè)經(jīng)上清感染的Vero細(xì)胞中KSHV裂解期和潛伏期基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá);將重組慢病毒Vpr感染PEL細(xì)胞系,然后轉(zhuǎn)染含KSHV ORF50/ORF73基因啟動(dòng)子的蟲(chóng)熒光素酶(Luciferase)報(bào)告質(zhì)粒,檢測(cè)Luciferase活性。3、以重組慢病毒Vpr感染BCBL-1細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行人信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片操作,采用Western blot對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,加入信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白激酶抑制劑、過(guò)表達(dá)突變質(zhì)粒后再檢測(cè)KSHV裂解期蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:1、攜帶Vpr基因的慢病毒獲得成功包裝,病毒滴度為4×107Tu/ml。重組慢病毒Vpr感染BCBL-1細(xì)胞后可檢測(cè)到Vpr基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。2、Vpr蛋白不但可以顯著抑制BCBL-1細(xì)胞中KSHV裂解期基因ORF50(編碼KSHV“分子開(kāi)關(guān)”蛋白)、ORF26(編碼KSHV次要衣殼蛋白)mRNA的轉(zhuǎn)錄,而且還能夠顯著降低KSHV裂解期蛋白病毒白細(xì)胞介素6(viral Interleukin-6,vIL-6)和KSHV復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活子(replication and transcription activator,Rta,即“分子開(kāi)關(guān)”蛋白)的表達(dá)。BCBL-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Vpr蛋白一方面能夠顯著下調(diào)KSHV的病毒拷貝數(shù),同時(shí)明顯地降低了Vero細(xì)胞中KSHV ORF73/LANA【潛伏相關(guān)核抗原,(latency-associated nuclear antigen)】、ORF26 mRNA的轉(zhuǎn)錄及vIL-6蛋白的表達(dá)。Vpr蛋白能夠直接抑制ORF50和ORF73基因啟動(dòng)子的活化。3、Vpr蛋白降低了GSK-3β【糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)】信號(hào)通路中GSK-3β的磷酸化水平,應(yīng)用GSK-3β抑制劑LiCl及過(guò)表達(dá)其突變質(zhì)粒GSK-3β-S9A后,Vpr蛋白對(duì)KSHV vIL-6的抑制作用分別被進(jìn)一步增強(qiáng)和部分阻斷。Vpr蛋白下調(diào)了PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)信號(hào)通路中PTEN的磷酸化水平,應(yīng)用其過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pTEN后,Vpr蛋白對(duì)KSHV vIL-6的抑制作用被進(jìn)一步增強(qiáng)。Vpr蛋白還降低了Ras/c-Raf/MEK/ERK信號(hào)通路中c-Raf、MEK1/2及ERK1/2的磷酸化水平。 結(jié)論:1、含Vpr基因重組慢病毒可以有效地感染BCBL-1細(xì)胞,并在其中大量表達(dá)目的蛋白。2、Vpr蛋白能夠顯著抑制KSHV裂解性周期復(fù)制及子代病毒顆粒的釋放,作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制ORF50和ORF73基因啟動(dòng)子的活化。3、Vpr蛋白通過(guò)抑制GSK-3β及PTEN信號(hào)通路的活化下調(diào)KSHV復(fù)制,Ras/c-Raf/MEK/ERK信號(hào)通路可能參與調(diào)控Vpr蛋白抑制KSHV復(fù)制過(guò)程。推測(cè)在AIDS相關(guān)的KS(AIDS-KS)患者體內(nèi),Vpr蛋白有可能通過(guò)抑制KSHV裂解性周期復(fù)制來(lái)避免KSHV感染細(xì)胞后過(guò)早地被免疫清除,從而有利于潛伏感染的形成和腫瘤的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 方欣;盧春;曹戌;李久明;秦娣;呂志剛;;HIV-I編碼病毒蛋白R(shí)基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)及其表達(dá)蛋白對(duì)KSHV溶解性周期復(fù)制的影響[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年09期

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本文編號(hào)：1588714