本文選題：NMDA　切入點：興奮性神經(jīng)毒　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒細胞模型中，觀察SIRT1發(fā)揮保護作用的信號通路。 背景：沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silentinformationregulator2homolog1,SIRT1）是Sirtuin家族的成員之一，廣泛存在于哺乳動物細胞中。SIRT1參與多種生命過程，如基因轉(zhuǎn)錄、組蛋白去乙酰化、細胞周期調(diào)節(jié)、糖脂代謝、細胞氧化應(yīng)激和抗衰老等。近年來，有關(guān)SIRT1的神經(jīng)保護作用受到人們越來越廣泛的關(guān)注。本研究室的研究結(jié)果也顯示，在NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷模型中，激動SIRT1或使SIRT1高表達均可以發(fā)揮神經(jīng)保護作用。 以往研究表明，p53、FOXO3a、HICl、E2F1等因子在轉(zhuǎn)錄水平對SIRT1的表達起調(diào)控作用，miRNA、HuR等因子可以在轉(zhuǎn)錄后水平對SIRT1的表達進行調(diào)控，AROS、DBCl、DYRKlA和DYRK3、MST1等可以在翻譯水平調(diào)控SIRT1的表達。但是對于SIRT1發(fā)揮作用的胞內(nèi)信號機制并未明確。 以往報道顯示，在氧化應(yīng)激模型中，HuR蛋白磷酸化可以使SIRT1蛋白表達下調(diào)。此外，胞內(nèi)PKC活化后可能使HuR發(fā)生磷酸化。而PKC作為一種Ca~(2+)依賴的蛋白激酶，當(dāng)被胞內(nèi)Ca~(2+)激活后，可以通過使底物蛋白磷酸化而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。已知突觸后膜NMDA受體過度激活引起胞外Ca~(2+)大量內(nèi)流，最終導(dǎo)致細胞損傷甚至死亡。基于本研究室前期實驗已經(jīng)證實，SIRT1在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒中發(fā)揮保護作用。由此我們推測：Ca~(2+) PKC HuR SIRT1途徑可能是調(diào)控SIRT1表達，影響SIRT1功能發(fā)揮的重要信號通路。 內(nèi)容和方法：本研究主要包括三部分實驗，（1）觀察HuR磷酸化通過對SIRT1的影響在興奮性神經(jīng)毒中發(fā)揮的作用。在NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒細胞模型中，應(yīng)用CCK-8分析、乳酸脫氫酶（LDH）檢測、Calcein-AM/PI雙染、Westernblotting（WB）、RT-PCR、免疫沉淀（IP）、酶活性檢測等方法，觀察HuR蛋白的磷酸化水平對SIRT1和興奮性神經(jīng)毒的影響；（2）觀察PKC激酶活性通過對HuR的影響在興奮性神經(jīng)毒中的作用。在NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒細胞模型中，應(yīng)用上述方法，觀察PKC激酶活性對HuR磷酸化水平和興奮性神經(jīng)毒的影響；（3）觀察Ca~(2+)對PKC激酶活性的影響在興奮性神經(jīng)毒中的作用。在NMDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒細胞模型中，應(yīng)用上述方法，觀察鈣螯合劑BAPTA對PKC激酶活性和興奮性神經(jīng)毒的影響。 結(jié)果：1、NMDA引起HuR蛋白磷酸化水平增加了45.5%（P0.05），SIRT1mRNA水平降低了36.33%（P0.05），SIRT1蛋白表達量減少了7.37%（P0.05），SIRT1酶活性降低了36.48%（P0.05），細胞活力降低了28.28%（P0.05），LDH釋放增加了48.14%（P0.05），活細胞數(shù)減少了27.89%（P0.05）。在HuR突變細胞中（突變了PKC作用的磷酸化位點，抑制了HuR的磷酸化），NMDA組的HuR蛋白磷酸化水平增加了20.61%（P0.05），SIRT1mRNA的水平降低了15.61%（P0.05），SIRT1蛋白水平降低了20.90%（P0.05），SIRT1酶活性降低了34.17%（P0.05），細胞活力降低了7.92%（P0.05），LDH釋放增加了17.70%（P0.05），活細胞數(shù)減少了9.63%（P0.05）。以上結(jié)果提示：在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒模型中，HuR可能通過其磷酸化使SIRT1mRNA、SIRT1蛋白水平及其酶活性發(fā)生下調(diào)。 2、NMDA組的PKC激酶活性增高了97.53%(P0.05)，HuR蛋白磷酸化水平增加41.40%(P0.05)，細胞活力降低了48.20%（P0.05），LDH釋放增加了69.09%（P0.05），活細胞數(shù)減少了58.19%（P0.05）；與對照組相比，PKC抑制劑組的PKC激酶活性增高了44.06%（P0.05），HuR蛋白磷酸化水平增高了13.70%（P0.05），細胞活力降低了19.29%（P0.05），LDH釋放增加了19.75%（P0.05），活細胞數(shù)減少了17.80%（P0.05）；與NMDA組相比，PKC抑制劑組的PKC激酶活性降低了48.43%（P0.05），HuR蛋白磷酸化水平降低了30.92%（P0.05），，細胞活力恢復(fù)了48.89％（P0.05），LDH釋放減少了28.26%(P0.05)，活細胞數(shù)增加了76.37%（P0.05）。以上結(jié)果提示：在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒模型中，激活PKC可能使HuR發(fā)生磷酸化，由此引起細胞損傷。 3、與NMDA組相比，鈣螯合劑BAPTA組的PKC激酶活性降低了65.60%（P0.05），細胞活力增加了88.66％（P0.05），LDH釋放減少了39.91%(P0.05)，活細胞數(shù)增加了45.09%(P0.05)。已知NMDA引起的Ca~(2+)內(nèi)流是導(dǎo)致其興奮毒性作用的關(guān)鍵因素，因此我們推測：NMDA可能通過介導(dǎo)Ca~(2+)內(nèi)流而激活PKC。結(jié)論：在NMDA誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒細胞模型中，NMDA引起胞外Ca~(2+)內(nèi)流，胞內(nèi)增高的Ca~(2+)激活PKC，活化的PKC使HuR磷酸化，磷酸化的HuR與SIRT1mRNA結(jié)合減少，從而使SIRT1mRNA穩(wěn)定性降低、SITR1表達下調(diào)，引起細胞損傷甚至死亡，即Ca~(2+) PKC HuR SIRT1途徑可能是調(diào)控SIRT1功能發(fā)揮的信號通路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：1579935