本文選題：胰島素樣生長因子1　切入點：缺氧缺血性腦損傷　出處：《鄭州大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因,嚴重危害新生兒健康,病情重,病死率和致殘率高。隨著新生兒科搶救水平及生命支持技術(shù)的提高,早產(chǎn)兒、嚴重窒息兒和各種腦損傷兒存活率大大提高,使得新生兒缺氧缺血.性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)的患病率不僅沒有減少,反而有升高的趨勢,已成為導(dǎo)致兒童殘疾的主要疾病之一,嚴重影響小兒身心發(fā)育和生活質(zhì)量,也給個人、家庭和社會帶來了極大的精神痛苦和沉重的經(jīng)濟負擔。傳統(tǒng)的治療方法如藥物治療、高壓氧治療等都僅局限于支持治療,只能在一定程度上緩解癥狀,難以促進神經(jīng)再生進而從根本上恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。 干細胞尤其是神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)的發(fā)現(xiàn)給HIE患者帶來了新的希望。大量的研究已經(jīng)證實,神經(jīng)干細胞由于具有自我更新和多向分化的潛能而成為修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的理想材料。NSCs研究成為目前生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點,而NSCs移植為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了新的方向。目前對NSCs的應(yīng)用研究主要集中存在以下兩個方面：一是將在體外分離培養(yǎng)并大量擴增的NSCs直接移植到神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位,從而起到修復(fù)作用；二是將NSCs作為載體,將有治療作用的特定基因克隆到NSCs而制作基因工程神經(jīng)干細胞,通過移植達到細胞替代和基因治療的雙重功效。 研究表明胰島素樣生長因子1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)不僅對大腦生長、發(fā)育、髓鞘的形成有重要的作用,而且是潛在的有絲分裂源,能夠在體外誘導(dǎo)神經(jīng)細胞和血管內(nèi)皮細胞的增殖、分化及調(diào)節(jié)細胞存活,同時體內(nèi)外多種創(chuàng)傷模型也顯示了其重要的神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護作用。有研究發(fā)現(xiàn),腦損傷后立即給予IGF-1可明顯減少神經(jīng)元死亡,能有效改善腦損傷引起的不良后果。 既往的研究顯示,單獨移植NSCs或IGF-1均能對HIBD動物模型發(fā)揮重要的治療作用,促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。但將二者聯(lián)合,選擇IGF-1對NSCs進行基因修飾構(gòu)造基因工程神經(jīng)干細胞,通過細胞移植探討對HIBD的治療研究還未見報道。本課題旨在尋求新的NSCs來源,構(gòu)造基因工程修飾神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1,通過對移植NSCs-IGF-1的HIBD大鼠的觀察,來探討基因工程修飾神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1治療HIBD的可行性,為臨床應(yīng)用NSCs-IGF-1治療HIBD奠定理論基礎(chǔ)。 目的 1.研究人臍帶血來源的神經(jīng)干細胞體外分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定的方法,觀察神經(jīng)干細胞增殖、傳代和分化規(guī)律,建立合適的體外穩(wěn)定培養(yǎng)體系。 2.構(gòu)建IGF-1真核表達載體pcDNA3.1-IGF-1,并轉(zhuǎn)染NSCs以建立基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1,為HIBD的治療打下基礎(chǔ)。 3.探討基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1移植對HIBD新生鼠腦部結(jié)構(gòu)和功能重建的影響,為臨床應(yīng)用基因工程神經(jīng)干細胞移植治療HIBD提供理論支持。 方法 1.無菌條件下取健康育齡產(chǎn)婦正常足月分娩胎兒臍帶血,肝素抗凝,等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后,密度梯度離心法分離其中單個核細胞。臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞,以1×106/mL密度將臍血單個核細胞接種到培養(yǎng)瓶,加入含有B27、EGF和bFGF的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細胞,3天后半量換液。待細胞培養(yǎng)至第7天,離心收集神經(jīng)球,使用胰蛋白酶消化法和機械法相結(jié)合的方法進行傳代,以5×105/mL將傳代后的神經(jīng)干細胞接種于新培養(yǎng)瓶,置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。P3代神經(jīng)干細胞加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,進行誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡動態(tài)觀察細胞生長狀況。 2.加入5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU) 20μmol/L對P3代臍血神經(jīng)干細胞進行標記。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3天后行免疫熒光化學(xué)染色檢測BrdU陽性細胞,對細胞的增殖能力進行鑒定。同時對分化前后的P3代神經(jīng)干細胞分別進行免疫細胞化學(xué)染色檢測Nestin、NSE、GFAP和MBP的表達,對神經(jīng)干細胞及其分化細胞進行鑒定。另外,對分化前的P3代臍血神經(jīng)干細胞進行G418最佳篩選濃度的測定。 3.從胎肝抽提總RNA,利用RT-PCR獲得目的基因IGF-1。將目的基因于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳,割膠回收目的基因片段。將該目的基因與質(zhì)粒pcDNA3.1進行連接構(gòu)建IGF-1的真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1。用氯化鈣法制備DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞,將連接液加入細胞進行轉(zhuǎn)化,次日挑取氨芐青霉素抗性菌落進行擴增,小量制備重組質(zhì)粒DNA。BamHⅠ與HindⅢ雙酶切對重組質(zhì)粒進行鑒定,同時將酶切正確的菌液進行測序鑒定。 4.搖菌擴增含有目的基因的重組質(zhì)粒,用SDS裂解法進行大量抽提。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染P3代臍血神經(jīng)干細胞,同時設(shè)立空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染對照組。G418篩選抗藥性克隆進行擴大培養(yǎng)。并用RT-PCR檢測IGF-1基因在基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞中的表達,將產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。免疫熒光細胞化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)IGF-1與Nestin的表達,對轉(zhuǎn)染效果進行鑒定。以含20%胎牛血清的新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)后,免疫熒光細胞化學(xué)法檢測NSE, GFAP和MBP在轉(zhuǎn)染細胞中的表達,對轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細胞的分化能力進行鑒定。 5.將80只SD大鼠通過結(jié)扎左頸總動脈,低氧箱中缺氧處理的方法,構(gòu)建新生大鼠HIBD模型,將造模后存活的75只大鼠隨機分成三組：模型對照組,NSCs移植組和NSCs-IGF-1移植組,每組25只。每組再進一步隨機分為1d組、7d組、14d組、21d組及肢體運動功能檢測組,每組5只。移植前3d,將基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1和未轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞進行BrdU標記(終濃度1μmol/L)。動物模型制備24h后按1.0mL/100g體重(細胞濃度為1×106/mL)行尾靜脈注入法進行細胞移植。取25只正常SD大鼠作為正常對照組,不進行模型制作,不移植任何細胞；NSCs-IGF-1移植組為HIBD模型大鼠經(jīng)尾靜脈移植基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1; NSCs移植組于相同部位注入等量神經(jīng)干細胞；模型對照組為HIBD大鼠注入等量生理鹽水。 6.各組動物每組5只分別在移植術(shù)后1d、7d、14d、21d處死,免疫熒光檢測BrdU表達情況,對移植細胞在腦內(nèi)的存活情況進行檢測。通過Nestin、NSE、GFAP免疫細胞化學(xué)染色觀察神經(jīng)干細胞增殖、分化及在大鼠腦內(nèi)分布情況,并通過Y-迷宮試驗和運動功能檢測對大鼠腦功能恢復(fù)情況進行觀察研究。 結(jié)果 1.原代培養(yǎng)的NSCs在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d左右可形成大量懸浮的神經(jīng)球,用胰蛋白酶消化法和機械法相結(jié)合的方法傳代后,細胞呈散在懸浮狀態(tài),37℃5%CO2條件下培養(yǎng)3-5d后,又可見中等大小神經(jīng)球出現(xiàn)在培養(yǎng)基中。隨著傳代的次數(shù)增加,細胞增殖速度逐漸減慢。P3代神經(jīng)干細胞經(jīng)過20%胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)1d后可見培養(yǎng)細胞開始貼壁,邊緣出現(xiàn)細的突起；誘導(dǎo)分化第3d,貼壁細胞可見突起生長；誘導(dǎo)分化第7d,可以觀察到神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。 2.P3代臍血神經(jīng)干細胞進行BrdU標記后,熒光顯微鏡下可觀察到大量BrdU表達陽性細胞。免疫細胞化學(xué)檢測顯示,原代及傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞Nestin表達呈陽性,而經(jīng)過20%胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后未見Nestin表達陽性的細胞,可見NSE, GFAP和MBP陽性細胞。同時,G418對P3代臍血神經(jīng)干細胞最佳篩選濃度為400ug/mL。 3.胎肝總RNA經(jīng)RT-PCR后產(chǎn)物電泳顯示在462bp處出現(xiàn)目的條帶,目的基因IGF-1與質(zhì)粒pcDNA3.1連接產(chǎn)物pcDNA3.1-IGF-1經(jīng)HindⅢ與BamH I雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在5428bp處和462bp處各有一條亮帶,空質(zhì)粒組只在5428bp處有一條亮帶,結(jié)果與質(zhì)粒載體及目的基因大小相符,證明所構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3.1-IGF-1大小及方向正確。對該重組體進行測序發(fā)現(xiàn)目的基因符合genebank序列(Nmol/L-000618),表明真核表達載體pcDNA3.1-IGF-1成功構(gòu)建。 4.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞后,加入含400ug/mL G418的篩選液篩選兩天后細胞開始死亡,一周后死亡細胞達高峰,之后細胞死亡漸漸減少,并且開始分裂增殖,2周后逐漸出現(xiàn)抗G418的陽性克隆,但未轉(zhuǎn)染細胞逐漸在含G418的篩選液中全部死亡。初步證明IGF-1基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞成功。收集抗藥性克隆,經(jīng)過RT-PCR檢測可得到一條約462bp的條帶,長度與目的基因相符,證明成功構(gòu)建了基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1。對此細胞行Nestin和IGF-1免疫熒光化學(xué)染色,均顯示陽性,表明IGF-1在轉(zhuǎn)染后的細胞中成功表達,且神經(jīng)干細胞的未分化狀態(tài)未因IGF-1的表達而改變。經(jīng)含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)7天后,可見基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞克隆分化為典型的神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞,免疫熒光細胞化學(xué)法檢測其NSE、GFAP和MBP染色陽性。 5.對SD大鼠通過結(jié)扎左頸總動脈和低氧處理后,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓,證明大鼠HIBD模型建立成功。 6.基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1移植HIBD動物模型后,用免疫熒光對BrdU示蹤結(jié)果顯示,NSCs移植組和NSCs-IGF-1移植組均可見到BrdU陽性細胞,且在觀察時間內(nèi)隨著細胞移植時間延長陽性細胞不斷增多。靜脈移植的BrdU陽性細胞可遷移至HIBD大鼠腦內(nèi)并進一步趨化至左側(cè)室管膜前下區(qū)(anterior subventricular zone, SVZa)存活下來。移植7d后,NSCs移植組和NSCs-IGF-1移植組間進行比較,BrdU陽性率差異顯著(p0.05)。 7.經(jīng)過HE染色,Nestin、NSE、GFAP免疫組化等方法顯示移植細胞可趨化至模型動物左側(cè)SVZa區(qū)存活并進行分化。在觀測時間點內(nèi),NSCs-IGF-1移植組Nestin陽性細胞表達量早期升高,移植后14d達峰,后逐漸下降,NSE陽性細胞表達量逐漸升高。而模型對照組在移植7d后Nestin及NSE陽性細胞表達量逐漸降低,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組SVZa區(qū)GFAP染色陽性細胞表達量總體逐漸升高,其中模型組表達最高,與NSCs-IGF-1移植組及正常對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05), NSCs- IGF-1移植組與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。大鼠學(xué)習(xí)記憶功能檢測及運動功能檢測結(jié)果均顯示NSCs-IGF-1移植組明顯優(yōu)于模型對照組,二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1.人臍血可以誘導(dǎo)培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞。 2.脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法能夠安全有效地將IGF-1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞。 3.成功構(gòu)建基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1,并且細胞的自我更新及多向分化潛能未因IGF-1基因的轉(zhuǎn)入而改變。 4.基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1移植后,細胞可以在HIBD大鼠腦內(nèi)存活、增殖與分化,并對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)發(fā)揮一定作用。因此基因工程神經(jīng)干細胞NSCs-IGF-1有望在HIBD的治療中發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：1579744