本文選題：幽門螺桿菌　切入點(diǎn)：可塑區(qū)基因　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:幽門螺桿菌(Hp)可塑區(qū)—JHP947基因與胃部疾病相關(guān)性研究,及其致病機(jī)制的初步探討。 方法: 第一部分1、從胃黏膜活檢組織中分離培養(yǎng)Hp,PCR擴(kuò)增分離菌株的JHP940、JHP947、JHP949和cagA基因,分析基因檢出與臨床疾病的關(guān)系。2、以Biodesign軟件確定并合成三個(gè)JHP947肽段, KLH交聯(lián)免疫家兔獲得多克隆抗體,免疫印跡方法鑒定JHP947基因是否表達(dá)相應(yīng)蛋白。 第二部分1、構(gòu)建幽門螺桿菌J99 JHP947基因缺失突變株:將J99菌株JHP947基因以及相鄰兩側(cè)(JHP946和JHP948)約2000bp的片斷克隆入質(zhì)粒pT7Blue,再反向PCR獲得大小約3553bp的長片斷,該片斷含有質(zhì)粒以及目的基因的相鄰兩側(cè)基因,不含JHP947,且其兩端含限制性內(nèi)切酶Pst1和Kpn1的位點(diǎn)。該長片段經(jīng)純化后與卡那霉素抗性基因(Km )相連接,經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后,在含氨芐青霉素和卡那霉素培養(yǎng)基中篩選陽性克隆。經(jīng)PCR、酶切鑒定后,擴(kuò)增,獲得同源重組質(zhì)粒,將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入J99,經(jīng)同源重組后在卡那霉素選擇性培養(yǎng)基中挑選陽性克隆,記作J99-947△突變株。2、鑒定:首先用PCR方法鑒定:用兩對(duì)引物PCR鑒定JHP945- Km片段和JHP947基因,以確定突變株中JHP947是否被Km基因替代。而后用免疫印跡(Western blot)方法鑒定:一抗為第一部分制備的兔抗JHP947抗體,二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG,免疫印跡鑒定J99-947△是否表達(dá)Hp947蛋白,以HpJ99菌株作陽性對(duì)照,不含JHP947基因的Hp26695菌株作陰性對(duì)照。最后鑒定突變株的穩(wěn)定性:突變株在含30 mg/L卡那霉素的布氏培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)25代,再按上述條件行相關(guān)基因片段的PCR擴(kuò)增,以鑒定突變菌株是否具有良好穩(wěn)定性。 第三部分應(yīng)用人類HG-U133-Plus2A基因表達(dá)譜芯片檢測J99野生株及J99-947△突變株對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)的影響,并比較表達(dá)的差異:將細(xì)胞以2.5×105個(gè)/ml接種于6cm孔板24h后,換無血清F-12細(xì)胞培養(yǎng)液同步化繼續(xù)培養(yǎng)24h后,以MOI比值為25:1(菌量為6.25 X 106CFU/ml)分別加入以無血清F-12培養(yǎng)液稀釋的幽門螺桿菌(J99、J99-947△),繼續(xù)共培養(yǎng)18h。空白對(duì)照孔不加細(xì)菌,只加不含血清的F-12細(xì)胞培養(yǎng)液,于37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)18h。提取處理過的AGS細(xì)胞總RNA進(jìn)行人類基因表達(dá)譜芯片檢測和分析,并應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證部分基因芯片結(jié)果。 第四部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測JHP947對(duì)幽門螺桿菌所致胃上皮細(xì)胞病變和基因表達(dá)的影響,將27只SPF級(jí)6 W齡C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組,分別以J99、J99-947△和PBS灌胃,菌量為109CFU/ml ,0、2、4d各一次,4W后宰殺所有小鼠,無菌操作取胃組織,分別作快速尿素酶試驗(yàn),Hp培養(yǎng),組織病理學(xué)檢查J99野生株與J99-947△突變株在小鼠胃中引起的炎癥變化有無差異;免疫組化檢測J99野生株與J99-947△突變株在小鼠胃中引起的ESE-3A、NDRG1、MATP基因表達(dá)有無差異。 結(jié)果: 第一部分1、分離獲得108株Hp,它們的JHP940、947、949和cagA基因在胃炎、潰瘍、胃癌中的檢出率分別為:JHP940-30.6%、22.6%、40.0%,JHP947-3.2%、32.2%、33.3%,JHP949-0、3.2%、13.3%,cagA -74.2%、93.5%、86.7%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,JHP940在胃炎、潰瘍、胃癌各組中的檢出率均無顯著性差異( P0.05 );JHP947在胃癌、潰瘍組中的檢出率顯著高于胃炎組( P0.00227,χ~2 =12.04; P0.00417,χ~2 =8.64),而在胃癌、潰瘍組中的檢出率無顯著性差異( P0.0125);JHP949在胃癌組中的檢出率顯著高于胃炎組( P0.00417,χ~2 = 8.48),而在其他組間差異無顯著性(P0.0125,χ~2 =1.69-2.02);cagA在胃炎、潰瘍、胃癌各組中的檢出率均無顯著性差異( P0.05)。JHP947和JHP949的檢出率呈正相關(guān)( P0.05,χ~2 = 6.034),JHP947和JHP940的檢出率無顯著相關(guān)性(P 0. 05,χ~2 = 2.939),JHP947和cagA的檢出率無顯著相關(guān)性(P 0. 05,χ~2 = 0.610)。2、Hp J99和臨床分離株的JHP947基因均表達(dá)相應(yīng)蛋白。 第二部分PCR鑒定顯示:J99-947△缺失JHP947基因,JHP945- Km片段PCR陽性,表明JHP947基因被Km基因替代。免疫印跡結(jié)果顯示:J99-947△不表達(dá)JHP947蛋白。連續(xù)培養(yǎng)25代后證實(shí), J99-947△具有良好穩(wěn)定性。 第三部分應(yīng)用人類HG-U133-Plus2A基因表達(dá)譜芯片檢測發(fā)現(xiàn):經(jīng)J99處理的AGS細(xì)胞與經(jīng)J99-947△處理的AGS細(xì)胞比較,前者有144個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中升高達(dá)2倍的有18個(gè), 216個(gè)基因表達(dá)下調(diào),其中下降達(dá)2倍的有107個(gè)基因,涉及腫瘤相關(guān)基因,細(xì)胞周期,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)錄因子,酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)基因,催化活性相關(guān)基因等。隨機(jī)抽取部分基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果與芯片分析結(jié)果吻合。 第四部分1、J99組和J99-947△組快速尿素酶試驗(yàn)和Hp培養(yǎng)的陽性率均為100%,PBS對(duì)照組快速尿素酶試驗(yàn)和Hp培養(yǎng)陰性。2、組織病理學(xué)檢查,PBS對(duì)照組小鼠胃黏膜100%正常, J99組小鼠胃黏膜33.3%(3/9)輕度糜爛,66.7%(6/9)重度糜爛。J99-947△組小鼠胃黏膜22.2%(2/9)正常,77.8%(7/9)輕度糜爛,沒有重度糜爛。J99組小鼠胃黏膜的損傷比J99-947△組重。3、免疫組化檢測結(jié)果, J99-947△組比J99組ESE-3A、NDRG1、MATP表達(dá)顯著升高(p0.05)。 結(jié)論: 1、JHP947與胃癌和消化性潰瘍的發(fā)生密切相關(guān)。 2、JHP947基因可導(dǎo)致細(xì)菌作用細(xì)胞后細(xì)胞的18個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào),107個(gè)基因明顯下調(diào)。主要涉及腫瘤相關(guān)基因,細(xì)胞周期,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)錄因子,酶活性調(diào)節(jié)相關(guān)基因,催化活性相關(guān)基因。 3、JHP947基因存在可使幽門螺桿菌感染所致的胃黏膜損傷程度加重。 4、在體內(nèi)JHP947基因可能通過下調(diào)NDRG1、MATP等腫瘤抑制基因的表達(dá)而與胃癌的發(fā)生有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1579129