本文選題：諾瓦克病毒　切入點：鼠諾瓦克病毒　出處：《東華大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：諾瓦克病毒(Noroviruses, NVs)又稱諾如病毒或小圓結(jié)構(gòu)病毒(Small round structured virus),是1972年在美國首次發(fā)現(xiàn)的新生病毒,直到1995年國內(nèi)才有報道。NVs是一組世界范圍內(nèi)引起的急性無菌性胃腸炎的重要病原,在全球感染人的非細菌性胃腸炎疾病的病例中超過90%是由該病毒引起的。該病毒是嚴重危害人類健康的重要食源性病毒,可導(dǎo)致不同年齡階段人群的急性病毒性腹瀉。被NVs感染的食品、水源和NVs感染者排泄物引起的糞口傳播是造成NVs感染的主要途徑,特點是發(fā)病率高、致病劑量低和對外界的抵抗力較強。感染的急性胃腸炎臨床主要包括：惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、發(fā)熱、厭食等。NVs屬于嵌杯狀病毒科的諾瓦克病毒屬,直徑約27-35nm,無囊膜,是單股正鏈RNA病毒的統(tǒng)稱。NVs基因全長約7.7kb,包括3個開放閱讀框(open reading frames, ORFs),依次是ORF1、ORF2和ORF3。NVs可分為5個基因群(gene group, GG),分別為GGⅠ、GGⅡ、GGⅢ、GGⅣ和GG V。其中NVGGⅠ、NVGGⅡ和NVGGⅣ主要感染人類,NVGGⅢ感染牛,NVGGⅤ則感染鼠類動物。由于NVGGⅤ只在鼠類動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn),因此又被稱之為鼠諾瓦克病毒(Murine noroviruses, MNV)。研究表明,MNV在生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子學(xué)上的特征都與NVs一樣；病毒的大小、形狀、浮力密度、基因結(jié)構(gòu)也與NVs很相似。NVs在體外不能增值,而MNV卻可以在傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞上生長并產(chǎn)生細胞病變,因此MNV成為了NVs的替代病毒進行研究,也是唯一的理想研究模型。MNV在實驗動物中廣泛傳播,幾乎所有的實驗小鼠對此病毒易感。報道稱MNV在糞便中能存留較長一段時間。因此,本研究從上海地區(qū)的實驗小鼠中采集小鼠糞便或者盲腸內(nèi)容物進行RT-PCR檢測,并在RAW264.7細胞上生長分離得到MNV病毒。 1.為了解實驗小鼠自然感染MNV的情況,采集送檢的80只實驗小鼠的糞便樣本,應(yīng)用RT-PCR方法擴增糞便樣本的MNV ORF2特異性基因(187bp, MNV nt5473-5659)片段。對PCR檢測為陽性的糞便樣本經(jīng)過10倍體積的PBS稀釋以后灌胃到4只ICR小鼠體內(nèi),一周以后,將3只ICR小鼠與灌胃的小鼠同居飼養(yǎng),觀察小鼠是否出現(xiàn)異常癥狀,定期采集糞便做RT-PCR檢測,研究小鼠實驗感染MNV的情況。一個月以后,處死小鼠,采集糞便、盲腸、十二指腸、脾、肝、大腦、腎、肺、心臟、胸腺、子宮、卵巢和唾液腺等器官做RT-PCR檢測,研究MNV的主要感染部位。結(jié)果表明：自然感染的陽性率為13.75%(11/80)；實驗感染的小鼠外表健康、活潑、沒有腹瀉現(xiàn)象,陽性率為100%；主要的感染部位為小鼠的消化系統(tǒng)。本研究是首次在上海地區(qū)實驗小鼠糞便中檢測到MNV。 2.RAW264.7細胞以5×106細胞/平板的密度培養(yǎng)在60mm的平板上,CO2孵化箱培養(yǎng)24個小時,直到形成80%～90%的單層細胞。將培養(yǎng)液倒掉,500μLPCR陽性結(jié)果的糞便懸液接種到RAW264.7單層細胞上。CO2孵化箱培養(yǎng)1個小時后,用無血清的培養(yǎng)基洗脫兩次,加10mL含5%的胎牛血清,培養(yǎng)48小時,使用Leica DMI3000顯微鏡拍照,觀察細胞的病變效應(yīng)。將平板保存在-80℃凍存,24小時后,平板置于室溫融解,經(jīng)過三次凍融以后,3000r/min離心5min,去除細胞碎片,上清液用于提取MNV的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行PCR。結(jié)果表明：目的條帶為187bp,與預(yù)期的相符。本研究成功的分離培養(yǎng)了MNV病毒。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373;R3416

【參考文獻】

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本文編號：1578969