本文選題：人胚胎干細(xì)胞　切入點(diǎn)：紅細(xì)胞　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 臨床輸血治療是最常用的細(xì)胞治療手段,然而目前血液來(lái)源緊張及輸血相關(guān)傳染病發(fā)生給其臨床應(yīng)用的安全性和廣泛性帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn),因此人們期望尋找更為安全、充足的血液來(lái)源。隨著干細(xì)胞發(fā)育及體外誘導(dǎo)分化研究的不斷深入,大量的研究表明人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hES細(xì)胞)在體外能夠誘導(dǎo)分化為成熟紅細(xì)胞作為新的血液來(lái)源,這種全新的血液替代來(lái)源有可能為解決目前臨床輸血治療面臨的問(wèn)題帶來(lái)希望,因此以hES細(xì)胞為啟動(dòng)細(xì)胞的造血細(xì)胞工程研究備受?chē)?guó)內(nèi)外關(guān)注,并具有廣泛的應(yīng)用前景和重大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。 目前,體外大規(guī)模誘導(dǎo)hES細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞并最終應(yīng)用于臨床還有很多關(guān)鍵的技術(shù)問(wèn)題需要解決,包括如何安全低成本的大規(guī)模擴(kuò)增hES細(xì)胞,如何高效率誘導(dǎo)hES細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化,如何高效率的使紅系細(xì)胞成熟并脫核,誘導(dǎo)分化成熟的紅系細(xì)胞是否能夠在體內(nèi)發(fā)揮功能,誘導(dǎo)獲得紅細(xì)胞的安全性和免疫排斥等問(wèn)題。 在以上問(wèn)題中,本研究擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究解決其中兩個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題,實(shí)現(xiàn)安全低成本的擴(kuò)增hES細(xì)胞和體外無(wú)血清培養(yǎng)體系下高效率的擴(kuò)增紅系祖細(xì)胞并向脫核紅細(xì)胞分化。希望通過(guò)解決以上兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題使hES細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化能夠更安全、高效,為最終誘導(dǎo)hES細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞解決臨床輸血治療面臨的問(wèn)題奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本研究主要包括兩部分內(nèi)容。 一、利用bFGF-hFLSCs作為人源化飼養(yǎng)層細(xì)胞體外擴(kuò)增hES細(xì)胞hES細(xì)胞建系和常規(guī)培養(yǎng)都是用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)做飼養(yǎng)層細(xì)胞或用MEF條件培養(yǎng)基(MEF conditional medium, MEF-CM)添加細(xì)胞因子在無(wú)飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)hES細(xì)胞,這種異基因來(lái)源的飼養(yǎng)層給hES細(xì)胞的應(yīng)用帶來(lái)很大的安全風(fēng)險(xiǎn)。為避免動(dòng)物源性飼養(yǎng)層可能帶來(lái)的污染,我們分離獲得了14周胎齡的人胎肝基質(zhì)細(xì)胞系(human fetal liver stromal cells, hFLSCs),其在體外可以長(zhǎng)期培養(yǎng)擴(kuò)增,能夠傳代35次仍保持正常的核型,形態(tài)學(xué)及其表面標(biāo)志表達(dá)均類(lèi)似人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)。hFLSCs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞可以維持hES細(xì)胞的增殖傳代達(dá)10-15次,hFLSCs飼養(yǎng)層培養(yǎng)的hES細(xì)胞經(jīng)RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)均表達(dá)hES細(xì)胞特異性的標(biāo)志,并保持其干性特征。免疫熒光結(jié)果表明hFLSCs和克隆邊緣分化hES細(xì)胞均表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(fibroblast growth factor receptor1, FGFR1),而未分化hES細(xì)胞表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor, IGF1R),提示bFGF通過(guò)作用于飼養(yǎng)層細(xì)胞和克隆邊緣少量分化的細(xì)胞來(lái)發(fā)揮其干性維持的作用。 bFGF是hES細(xì)胞體外培養(yǎng)中唯一必需的細(xì)胞因子,其在hES細(xì)胞的干性維持中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。為建立穩(wěn)定表達(dá)bFGF的hFLSCs,我們首先從hMSCs中用RT-PCR擴(kuò)增出bFGF基因,將其連入慢病毒載體pBPLV,構(gòu)建bFGF的慢病毒表達(dá)載體bFGF-pBPLV,在293-FT細(xì)胞中包裝病毒后轉(zhuǎn)染hFLSCs。為了獲得bFGF分泌量更高的hFLSCs,我們將轉(zhuǎn)染后的hFLSCs用流式細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting, FACS)分為弱熒光表達(dá)和強(qiáng)熒光表達(dá)的兩群細(xì)胞,我們將強(qiáng)熒光表達(dá)的命名為bFGF-hFLSCs,弱熒光表達(dá)的命名為L(zhǎng)ow-bFGF-hFLSCs。bFGF-hFLSCs在形態(tài)學(xué)、表面分子表達(dá)及生長(zhǎng)特性等方面與hFLSCs相比無(wú)明顯變化,用RT-PCR、Western blot和ELISA等方法證明bFGF-hFLSCs可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)bFGF蛋白。 進(jìn)一步的研究則表明,bFGF-hFLSCs作為飼養(yǎng)層細(xì)胞能在不添加外源bFGF時(shí)維持hES細(xì)胞生長(zhǎng),hES細(xì)胞在bFGF-hFLSCs上培養(yǎng)可以傳代10-15代,并對(duì)傳代培養(yǎng)的hES細(xì)胞從多個(gè)方面進(jìn)行了鑒定,包括RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)特異性標(biāo)志表達(dá),通過(guò)擬胚體(embryoid body, EB)形成驗(yàn)證其體外多向分化能力,RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)了三個(gè)胚層特異性標(biāo)志的表達(dá),結(jié)果均表明bFGF-hFLSCs上培養(yǎng)擴(kuò)增的hES細(xì)胞保持了其自我更新和多向分化能力。 我們對(duì)bFGF-hFLSCs體外維持hES干性的機(jī)制進(jìn)行了初步研究,通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明bFGF-hFLSCs與hFLSCs相比其IGF2表達(dá)明顯上調(diào),RT-PCR檢測(cè)表明bFGF-hFLSCs與hFLSCs相比其TGF-β、FGFR1和IGF1R的表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)。結(jié)果提示我們bFGF-hFLSCs可能通過(guò)分泌IGF2和TGF-β等細(xì)胞因子與hES細(xì)胞表面的IGF1R和其他受體結(jié)合,發(fā)揮其干性維持作用。 在本部分實(shí)驗(yàn)中我們利用bFGF-hFLSCs作飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)hES細(xì)胞,建立了一個(gè)人源化不需添加外源bFGF的體外擴(kuò)增hES細(xì)胞培養(yǎng)體系,降低了培養(yǎng)成本,提高了安全性。同時(shí)我們對(duì)bFGF-hFLSCs維持hES細(xì)胞干性的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。 二、誘導(dǎo)hES細(xì)胞向造血干/祖細(xì)分化及誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)分化為成熟紅細(xì)胞 為了建立誘導(dǎo)hES細(xì)胞體外分化為成熟紅細(xì)胞的技術(shù),我們?cè)诟倪M(jìn)hES細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上,將hES細(xì)胞在細(xì)胞因子的作用下通過(guò)形成EB的方法使其向造血細(xì)胞誘導(dǎo)分化,可以獲得早期的血液血管干細(xì)胞(hemangioblst, HA)和造血干/祖細(xì)胞。從誘導(dǎo)第4天的EB細(xì)胞中,用半固體克隆培養(yǎng)得到HA體外培養(yǎng)的BL-CFC(blast-clony forming cells)克隆,BL-CFC可以繼續(xù)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞和造血細(xì)胞。從誘導(dǎo)第14天的EB內(nèi)獲得CD34+造血干細(xì)胞的比例可以達(dá)到9.54%,hES細(xì)胞來(lái)源的CD34+細(xì)胞在半固體克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)可以向各系造血細(xì)胞分化,并能夠在體外繼續(xù)增殖和進(jìn)一步分化。誘導(dǎo)獲得的造血干/祖細(xì)胞能夠作為繼續(xù)向成熟細(xì)胞誘導(dǎo)分化的起始細(xì)胞,由于hES細(xì)胞具有理論上的“無(wú)限”增殖能力,因此可以從hES細(xì)胞獲得充足的造血干/祖用于后續(xù)的成熟紅細(xì)胞分化。 為了建立高效的紅系祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系,我們利用臍帶血來(lái)源HSCs作為起始細(xì)胞,在無(wú)血清培養(yǎng)體系下高效率誘導(dǎo)其分化為紅系祖細(xì)胞,結(jié)果表明細(xì)胞能夠維持?jǐn)U增達(dá)50天,細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增108-109倍,誘導(dǎo)來(lái)源的紅系祖細(xì)胞通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、瑞氏-姬姆薩染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志和半固體克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法加以證明,從而表明在該體系下可以特異性的擴(kuò)增紅系祖細(xì)胞。 近來(lái)的研究表明將紅系祖細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)是體外誘導(dǎo)其脫核的高效方法,而胎肝是胚胎期紅系細(xì)胞發(fā)育成熟的重要器官,我們分離了24周胎齡hFLSCs,對(duì)其表面標(biāo)志和細(xì)胞體外增殖等特性進(jìn)行了鑒定,然后將誘導(dǎo)獲得紅系祖細(xì)胞與hFLSCs共培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)了紅系祖細(xì)胞的高效率脫核,脫核比例能夠達(dá)到80%-90%。利用RT-PCR檢測(cè)了HSCs向脫核紅細(xì)胞分化時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)的血紅蛋白表達(dá)模式,結(jié)果表明在mRNA水平與hFLSCs共培養(yǎng)獲得的紅細(xì)胞高表達(dá)成體β血紅蛋白,而不表達(dá)胚胎期和胎兒期的ξ和ε血紅蛋白。同時(shí)用RT-PCR檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)紅系發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SCL/TAL-1、PU-1和GATA-1的表達(dá)情況,初步證明與hFLSCs共培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化模型可以模擬正常的紅系發(fā)育,并有望用于規(guī)�；募t細(xì)胞誘導(dǎo)成熟和紅系發(fā)育分化的機(jī)制研究。 總結(jié) 本研究針對(duì)hES細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)研究,首先用轉(zhuǎn)基因的bFGF-hFLSCs作為飼養(yǎng)層實(shí)現(xiàn)體外人源化低成本的擴(kuò)增hES細(xì)胞,為hES的誘導(dǎo)分化提供充足的種子細(xì)胞。同時(shí)誘導(dǎo)hES細(xì)胞分化為HA和HSCs,并在無(wú)血清體系誘導(dǎo)臍帶血來(lái)源HSCs高效特異地向紅系祖細(xì)胞分化,進(jìn)而通過(guò)紅系祖細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng),高效率誘導(dǎo)紅細(xì)胞脫核,最終形成成熟紅細(xì)胞。這些研究結(jié)果將為最終實(shí)現(xiàn)hES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為成熟紅細(xì)胞作為血液替代來(lái)源奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1575521