本文選題：人胚胎干細胞　切入點：紅細胞　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 臨床輸血治療是最常用的細胞治療手段,然而目前血液來源緊張及輸血相關(guān)傳染病發(fā)生給其臨床應(yīng)用的安全性和廣泛性帶來了巨大挑戰(zhàn),因此人們期望尋找更為安全、充足的血液來源。隨著干細胞發(fā)育及體外誘導(dǎo)分化研究的不斷深入,大量的研究表明人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hES細胞)在體外能夠誘導(dǎo)分化為成熟紅細胞作為新的血液來源,這種全新的血液替代來源有可能為解決目前臨床輸血治療面臨的問題帶來希望,因此以hES細胞為啟動細胞的造血細胞工程研究備受國內(nèi)外關(guān)注,并具有廣泛的應(yīng)用前景和重大的社會經(jīng)濟效益。 目前,體外大規(guī)模誘導(dǎo)hES細胞分化為成熟紅細胞并最終應(yīng)用于臨床還有很多關(guān)鍵的技術(shù)問題需要解決,包括如何安全低成本的大規(guī)模擴增hES細胞,如何高效率誘導(dǎo)hES細胞向紅系細胞分化,如何高效率的使紅系細胞成熟并脫核,誘導(dǎo)分化成熟的紅系細胞是否能夠在體內(nèi)發(fā)揮功能,誘導(dǎo)獲得紅細胞的安全性和免疫排斥等問題。 在以上問題中,本研究擬通過實驗研究解決其中兩個關(guān)鍵性技術(shù)問題,實現(xiàn)安全低成本的擴增hES細胞和體外無血清培養(yǎng)體系下高效率的擴增紅系祖細胞并向脫核紅細胞分化。希望通過解決以上兩個關(guān)鍵技術(shù)問題使hES細胞向成熟紅細胞分化能夠更安全、高效,為最終誘導(dǎo)hES細胞分化為成熟紅細胞解決臨床輸血治療面臨的問題奠定實驗基礎(chǔ)。 本研究主要包括兩部分內(nèi)容。 一、利用bFGF-hFLSCs作為人源化飼養(yǎng)層細胞體外擴增hES細胞hES細胞建系和常規(guī)培養(yǎng)都是用小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)做飼養(yǎng)層細胞或用MEF條件培養(yǎng)基(MEF conditional medium, MEF-CM)添加細胞因子在無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)hES細胞,這種異基因來源的飼養(yǎng)層給hES細胞的應(yīng)用帶來很大的安全風(fēng)險。為避免動物源性飼養(yǎng)層可能帶來的污染,我們分離獲得了14周胎齡的人胎肝基質(zhì)細胞系(human fetal liver stromal cells, hFLSCs),其在體外可以長期培養(yǎng)擴增,能夠傳代35次仍保持正常的核型,形態(tài)學(xué)及其表面標(biāo)志表達均類似人間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)。hFLSCs作為飼養(yǎng)層細胞可以維持hES細胞的增殖傳代達10-15次,hFLSCs飼養(yǎng)層培養(yǎng)的hES細胞經(jīng)RT-PCR和免疫熒光檢測均表達hES細胞特異性的標(biāo)志,并保持其干性特征。免疫熒光結(jié)果表明hFLSCs和克隆邊緣分化hES細胞均表達堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的受體成纖維細胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor1, FGFR1),而未分化hES細胞表達胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor, IGF1R),提示bFGF通過作用于飼養(yǎng)層細胞和克隆邊緣少量分化的細胞來發(fā)揮其干性維持的作用。 bFGF是hES細胞體外培養(yǎng)中唯一必需的細胞因子,其在hES細胞的干性維持中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。為建立穩(wěn)定表達bFGF的hFLSCs,我們首先從hMSCs中用RT-PCR擴增出bFGF基因,將其連入慢病毒載體pBPLV,構(gòu)建bFGF的慢病毒表達載體bFGF-pBPLV,在293-FT細胞中包裝病毒后轉(zhuǎn)染hFLSCs。為了獲得bFGF分泌量更高的hFLSCs,我們將轉(zhuǎn)染后的hFLSCs用流式細胞分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting, FACS)分為弱熒光表達和強熒光表達的兩群細胞,我們將強熒光表達的命名為bFGF-hFLSCs,弱熒光表達的命名為Low-bFGF-hFLSCs。bFGF-hFLSCs在形態(tài)學(xué)、表面分子表達及生長特性等方面與hFLSCs相比無明顯變化,用RT-PCR、Western blot和ELISA等方法證明bFGF-hFLSCs可以長期穩(wěn)定表達bFGF蛋白。 進一步的研究則表明,bFGF-hFLSCs作為飼養(yǎng)層細胞能在不添加外源bFGF時維持hES細胞生長,hES細胞在bFGF-hFLSCs上培養(yǎng)可以傳代10-15代,并對傳代培養(yǎng)的hES細胞從多個方面進行了鑒定,包括RT-PCR和免疫熒光檢測特異性標(biāo)志表達,通過擬胚體(embryoid body, EB)形成驗證其體外多向分化能力,RT-PCR和免疫熒光檢測了三個胚層特異性標(biāo)志的表達,結(jié)果均表明bFGF-hFLSCs上培養(yǎng)擴增的hES細胞保持了其自我更新和多向分化能力。 我們對bFGF-hFLSCs體外維持hES干性的機制進行了初步研究,通過RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明bFGF-hFLSCs與hFLSCs相比其IGF2表達明顯上調(diào),RT-PCR檢測表明bFGF-hFLSCs與hFLSCs相比其TGF-β、FGFR1和IGF1R的表達均出現(xiàn)上調(diào)。結(jié)果提示我們bFGF-hFLSCs可能通過分泌IGF2和TGF-β等細胞因子與hES細胞表面的IGF1R和其他受體結(jié)合,發(fā)揮其干性維持作用。 在本部分實驗中我們利用bFGF-hFLSCs作飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)hES細胞,建立了一個人源化不需添加外源bFGF的體外擴增hES細胞培養(yǎng)體系,降低了培養(yǎng)成本,提高了安全性。同時我們對bFGF-hFLSCs維持hES細胞干性的機制進行了初步探討。 二、誘導(dǎo)hES細胞向造血干/祖細分化及誘導(dǎo)造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSCs)分化為成熟紅細胞 為了建立誘導(dǎo)hES細胞體外分化為成熟紅細胞的技術(shù),我們在改進hES細胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上,將hES細胞在細胞因子的作用下通過形成EB的方法使其向造血細胞誘導(dǎo)分化,可以獲得早期的血液血管干細胞(hemangioblst, HA)和造血干/祖細胞。從誘導(dǎo)第4天的EB細胞中,用半固體克隆培養(yǎng)得到HA體外培養(yǎng)的BL-CFC(blast-clony forming cells)克隆,BL-CFC可以繼續(xù)分化為內(nèi)皮樣細胞和造血細胞。從誘導(dǎo)第14天的EB內(nèi)獲得CD34+造血干細胞的比例可以達到9.54%,hES細胞來源的CD34+細胞在半固體克隆形成實驗時可以向各系造血細胞分化,并能夠在體外繼續(xù)增殖和進一步分化。誘導(dǎo)獲得的造血干/祖細胞能夠作為繼續(xù)向成熟細胞誘導(dǎo)分化的起始細胞,由于hES細胞具有理論上的“無限”增殖能力,因此可以從hES細胞獲得充足的造血干/祖用于后續(xù)的成熟紅細胞分化。 為了建立高效的紅系祖細胞誘導(dǎo)分化體系,我們利用臍帶血來源HSCs作為起始細胞,在無血清培養(yǎng)體系下高效率誘導(dǎo)其分化為紅系祖細胞,結(jié)果表明細胞能夠維持擴增達50天,細胞數(shù)量擴增108-109倍,誘導(dǎo)來源的紅系祖細胞通過形態(tài)學(xué)觀察、瑞氏-姬姆薩染色、流式細胞術(shù)檢測表面標(biāo)志和半固體克隆形成實驗等方法加以證明,從而表明在該體系下可以特異性的擴增紅系祖細胞。 近來的研究表明將紅系祖細胞與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)是體外誘導(dǎo)其脫核的高效方法,而胎肝是胚胎期紅系細胞發(fā)育成熟的重要器官,我們分離了24周胎齡hFLSCs,對其表面標(biāo)志和細胞體外增殖等特性進行了鑒定,然后將誘導(dǎo)獲得紅系祖細胞與hFLSCs共培養(yǎng),實現(xiàn)了紅系祖細胞的高效率脫核,脫核比例能夠達到80%-90%。利用RT-PCR檢測了HSCs向脫核紅細胞分化時不同時間點的血紅蛋白表達模式,結(jié)果表明在mRNA水平與hFLSCs共培養(yǎng)獲得的紅細胞高表達成體β血紅蛋白,而不表達胚胎期和胎兒期的ξ和ε血紅蛋白。同時用RT-PCR檢測了不同時間點紅系發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SCL/TAL-1、PU-1和GATA-1的表達情況,初步證明與hFLSCs共培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化模型可以模擬正常的紅系發(fā)育,并有望用于規(guī)�；募t細胞誘導(dǎo)成熟和紅系發(fā)育分化的機制研究。 總結(jié) 本研究針對hES細胞向成熟紅細胞分化過程中的兩個關(guān)鍵技術(shù)問題開展了實驗研究,首先用轉(zhuǎn)基因的bFGF-hFLSCs作為飼養(yǎng)層實現(xiàn)體外人源化低成本的擴增hES細胞,為hES的誘導(dǎo)分化提供充足的種子細胞。同時誘導(dǎo)hES細胞分化為HA和HSCs,并在無血清體系誘導(dǎo)臍帶血來源HSCs高效特異地向紅系祖細胞分化,進而通過紅系祖細胞與基質(zhì)細胞的共培養(yǎng),高效率誘導(dǎo)紅細胞脫核,最終形成成熟紅細胞。這些研究結(jié)果將為最終實現(xiàn)hES細胞體外誘導(dǎo)分化為成熟紅細胞作為血液替代來源奠定實驗基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：1575521