本文選題：幽門螺桿菌　切入點(diǎn)：熱休克蛋白60　出處：《濱州醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：分析幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)臨床分離株熱休克蛋白60 (heat shock protein 60, Hsp60)基因編碼區(qū)序列特征,并通過定點(diǎn)突變及構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)制備野生型與突變型Hsp60重組蛋白,研究?jī)煞N重組蛋白對(duì)胃上皮細(xì)胞IL-8誘生作用的差異。方法：1.將不同疾病來源的胃黏膜標(biāo)本研磨后,均勻涂布于Hp選擇培養(yǎng)基上,37℃微需氧條件下培養(yǎng)3天,培養(yǎng)物經(jīng)菌落特征、革蘭染色、快速尿素酶試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)鑒定；2.提取所有分離到的Hp的基因組DNA,根據(jù)GeneBank中已公布的HpATCC26695菌株Hsp60基因的全長(zhǎng)序列,采用Primer Premier50軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物,PCR擴(kuò)增Hsp60基因,切膠純化后進(jìn)行序列測(cè)定,采用DNAstar 5.0軟件中的MegAlign程序進(jìn)行比對(duì)分析；3.采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)Hsp60基因的兩對(duì)引物,引入突變位點(diǎn),以Hp ATCC26695基因組DNA為模板,通過重疊延伸PCR法進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增,獲得突變型Hsp60基因；另利用上下游引物,PCR擴(kuò)增野生型的Hsp60基因；4.將野生型與突變型的Hsp60基因克隆至pEASY-E1載體,構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng),進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；利用脫鹽柱及內(nèi)毒素去除柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化；并進(jìn)行蛋白濃度及內(nèi)毒素含量的測(cè)定；5.將純化的野生型及突變型Hsp60蛋白與胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng),收集上清液,ELISA檢測(cè)IL-8的表達(dá)水平。結(jié)果：1.將標(biāo)本接種于Hp選擇培養(yǎng)基置微需氧環(huán)境中37℃培養(yǎng)3天后,培養(yǎng)基上出現(xiàn)針尖大小的透明菌落。革蘭氏染色后油鏡下可見弧形、海鷗狀以及S形的革蘭陰性菌,且尿素酶、氧化酶試驗(yàn)均為陽性,為Hp臨床分離株。2.非胃癌來源與胃癌來源Hp的Hsp60基因的編碼區(qū)序列在877、1 399以及1579位點(diǎn)處存在差異：在877位點(diǎn)處發(fā)生了G→A的堿基置換,上述兩種來源菌株數(shù)分別為8株(8/45,17.78%)和3株(3/18,16.67%)；在1399位點(diǎn)處發(fā)生了C→G的堿基置換,菌株數(shù)分別為9株(9/45,20.00%)和1株(1/18,5.55%)；在1 579位點(diǎn)處發(fā)生了A→G的堿基置換,菌株數(shù)分別為7株(7/45,15.56%)和2株(2/18,11.11%)；以上三位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列,即293、467以及527位點(diǎn)處,分別發(fā)生了由纈氨酸(V)到異亮氨基酸(I)、谷氨酰胺(Q)到谷氨酸(E)以及蘇氨酸(T)到丙氨酸(A)的改變。3.定點(diǎn)突變后,經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析,Hp ATCC26695 Hsp60基因的編碼區(qū)序列1398、1399位點(diǎn)由原來的AG突變?yōu)镚C。4.構(gòu)建pEASY-El-Hsp60原核表達(dá)載體,SDS-PAGE檢測(cè),在相對(duì)分子質(zhì)量55-72 kDa處有一明顯條帶,與預(yù)期的6His-Hsp60融合蛋白大小一致。當(dāng)菌液OD600為0.4,IPTG終濃度為1.0 mM,誘導(dǎo)時(shí)間4 h時(shí),目的重組蛋白表達(dá)量相對(duì)較高。5.將重組蛋白與細(xì)胞共培養(yǎng)后,蛋白組比PBS對(duì)照組的IL-8濃度高,且加入內(nèi)毒素抑制劑PMB后IL-8濃度的降低沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；在蛋白濃度為50μg/ml時(shí),突變型Hsp60組和野生型Hsp60組IL-8的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.成功分離到63株不同疾病來源的臨床Hp菌株,為后續(xù)研究Hp致病性差異建立了菌株資源基礎(chǔ)。2.非胃癌來源與胃癌來源Hp的Hsp60基因的編碼區(qū)序列在877、1 399以及1579位點(diǎn)處存在單核苷酸多態(tài)性。3.本研究制備的HpHsp60重組蛋白可以誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子IL-8,且與內(nèi)毒素污染無關(guān)；野生型與突變型Hsp60對(duì)胃上皮細(xì)胞的炎癥誘生作用存在差異,且突變型強(qiáng)于野生型。
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【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
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本文編號(hào)：1570967