本文選題：幽門螺桿菌　切入點：熱休克蛋白60　出處：《濱州醫(yī)學院》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：分析幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)臨床分離株熱休克蛋白60 (heat shock protein 60, Hsp60)基因編碼區(qū)序列特征,并通過定點突變及構(gòu)建原核表達系統(tǒng)制備野生型與突變型Hsp60重組蛋白,研究兩種重組蛋白對胃上皮細胞IL-8誘生作用的差異。方法：1.將不同疾病來源的胃黏膜標本研磨后,均勻涂布于Hp選擇培養(yǎng)基上,37℃微需氧條件下培養(yǎng)3天,培養(yǎng)物經(jīng)菌落特征、革蘭染色、快速尿素酶試驗和氧化酶試驗鑒定；2.提取所有分離到的Hp的基因組DNA,根據(jù)GeneBank中已公布的HpATCC26695菌株Hsp60基因的全長序列,采用Primer Premier50軟件設(shè)計一對引物,PCR擴增Hsp60基因,切膠純化后進行序列測定,采用DNAstar 5.0軟件中的MegAlign程序進行比對分析；3.采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計Hsp60基因的兩對引物,引入突變位點,以Hp ATCC26695基因組DNA為模板,通過重疊延伸PCR法進行3次PCR擴增,獲得突變型Hsp60基因；另利用上下游引物,PCR擴增野生型的Hsp60基因；4.將野生型與突變型的Hsp60基因克隆至pEASY-E1載體,構(gòu)建原核表達系統(tǒng),進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達；利用脫鹽柱及內(nèi)毒素去除柱對重組蛋白進行純化；并進行蛋白濃度及內(nèi)毒素含量的測定；5.將純化的野生型及突變型Hsp60蛋白與胃上皮細胞GES-1共培養(yǎng),收集上清液,ELISA檢測IL-8的表達水平。結(jié)果：1.將標本接種于Hp選擇培養(yǎng)基置微需氧環(huán)境中37℃培養(yǎng)3天后,培養(yǎng)基上出現(xiàn)針尖大小的透明菌落。革蘭氏染色后油鏡下可見弧形、海鷗狀以及S形的革蘭陰性菌,且尿素酶、氧化酶試驗均為陽性,為Hp臨床分離株。2.非胃癌來源與胃癌來源Hp的Hsp60基因的編碼區(qū)序列在877、1 399以及1579位點處存在差異：在877位點處發(fā)生了G→A的堿基置換,上述兩種來源菌株數(shù)分別為8株(8/45,17.78%)和3株(3/18,16.67%)；在1399位點處發(fā)生了C→G的堿基置換,菌株數(shù)分別為9株(9/45,20.00%)和1株(1/18,5.55%)；在1 579位點處發(fā)生了A→G的堿基置換,菌株數(shù)分別為7株(7/45,15.56%)和2株(2/18,11.11%)；以上三位點所對應(yīng)的氨基酸序列,即293、467以及527位點處,分別發(fā)生了由纈氨酸(V)到異亮氨基酸(I)、谷氨酰胺(Q)到谷氨酸(E)以及蘇氨酸(T)到丙氨酸(A)的改變。3.定點突變后,經(jīng)測序比對分析,Hp ATCC26695 Hsp60基因的編碼區(qū)序列1398、1399位點由原來的AG突變?yōu)镚C。4.構(gòu)建pEASY-El-Hsp60原核表達載體,SDS-PAGE檢測,在相對分子質(zhì)量55-72 kDa處有一明顯條帶,與預(yù)期的6His-Hsp60融合蛋白大小一致。當菌液OD600為0.4,IPTG終濃度為1.0 mM,誘導(dǎo)時間4 h時,目的重組蛋白表達量相對較高。5.將重組蛋白與細胞共培養(yǎng)后,蛋白組比PBS對照組的IL-8濃度高,且加入內(nèi)毒素抑制劑PMB后IL-8濃度的降低沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)；在蛋白濃度為50μg/ml時,突變型Hsp60組和野生型Hsp60組IL-8的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論：1.成功分離到63株不同疾病來源的臨床Hp菌株,為后續(xù)研究Hp致病性差異建立了菌株資源基礎(chǔ)。2.非胃癌來源與胃癌來源Hp的Hsp60基因的編碼區(qū)序列在877、1 399以及1579位點處存在單核苷酸多態(tài)性。3.本研究制備的HpHsp60重組蛋白可以誘導(dǎo)GES-1細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子IL-8,且與內(nèi)毒素污染無關(guān)；野生型與突變型Hsp60對胃上皮細胞的炎癥誘生作用存在差異,且突變型強于野生型。
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【學位授予單位】：濱州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378
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本文編號：1570967