本文選題：糖氧剝奪　切入點(diǎn)：GFAP　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：前言 反應(yīng)性膠質(zhì)化的主要表現(xiàn)為星形膠質(zhì)增生和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)增加。它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種腦損傷后的修復(fù)反應(yīng),但過度的膠質(zhì)化反應(yīng)將形成膠質(zhì)瘢痕進(jìn)而影響神經(jīng)修復(fù)和軸突再生。因此,研究膠質(zhì)化的調(diào)控以減少膠質(zhì)化反應(yīng)的負(fù)面影響顯得尤為重要。 腺苷A1受體(A1R)和A2a受體(A2aR)是4種腺苷受體(A1、A2a、A2b及A3)中的最主要的2種亞型,它們作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后可產(chǎn)生不同效應(yīng):AIR拮抗劑可部分抑制ATP對(duì)膠質(zhì)化反應(yīng)的誘導(dǎo)作用,提示A1R可能抑制反應(yīng)性膠質(zhì)化;而在A2aR的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),A2aR基因敲除小鼠的GFAP表達(dá)減少;A2aR拮抗劑Sch58261可部分逆轉(zhuǎn)bFGF對(duì)膠質(zhì)化反應(yīng)的誘導(dǎo)作用。這些體內(nèi)外研究提示A2aR可能誘導(dǎo)反應(yīng)性膠質(zhì)化,具有與A1R相拮抗的作用。缺血缺氧損傷后,A1R與A2aR是否參與膠質(zhì)化?其機(jī)制如何?此外,體內(nèi)外研究證實(shí),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中A1R與A2aR可產(chǎn)生相互拮抗的生物學(xué)作用,如腦缺血后A1R具有神經(jīng)保護(hù)作用,而A2aR對(duì)神經(jīng)修復(fù)具有損傷作用。那么在缺血缺氧后的反應(yīng)性膠質(zhì)化中,二者是否可產(chǎn)生相互拮抗的作用?二者是否存在相互作用?均尚未見報(bào)道。 為了探討上述問題,本課題通過星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖氧剝奪建立體外缺血缺氧模型,采用Western blot、基因轉(zhuǎn)染以及免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)方法,觀察A1R與A2aR在缺血缺氧/再灌條件下對(duì)反應(yīng)性膠質(zhì)化的影響,并探討與之相關(guān)的信號(hào)通路。此外,本課題還初步探討了A1R與A2aR之間的相互作用及其相關(guān)的信號(hào)通路,以期能夠?yàn)榉磻?yīng)性膠質(zhì)化的調(diào)控及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分腺苷A1受體在反應(yīng)性膠質(zhì)化中的作用及其機(jī)制 目的研究體外糖氧剝奪后A1R在反應(yīng)性膠質(zhì)化中的作用及其相關(guān)的信號(hào)通路 方法培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系RBA-2細(xì)胞,以GFAP表達(dá)作為膠質(zhì)化反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志;采用Western blot方法,觀察A1R激動(dòng)劑CPA與拮抗劑DPCPX在糖氧剝奪基礎(chǔ)后對(duì)GFAP表達(dá)影響,并用Western blot方法初步探討Akt以及Jak2/STAT3信號(hào)通路的改變。 結(jié)果糖氧剝奪后,A1R激動(dòng)劑CPA能抑制RBA-2細(xì)胞中GFAP蛋白表達(dá),A1R拮抗劑DPCPX可逆轉(zhuǎn)CPA對(duì)GFAP表達(dá)的影響;CPA呈劑量依賴性上調(diào)p-Akt水平,而DPCPX預(yù)處理可抑制CPA對(duì)p-Akt的影響。阻斷Akt可上調(diào)GFAP表達(dá),并逆轉(zhuǎn)CPA對(duì)GFAP蛋白表達(dá)的抑制作用。CPA作用于RBA-2細(xì)胞后,可使p-Jak2水平下降但對(duì)p-STAT3水平無明顯影響。阻斷Akt可上調(diào)p-Jak2水平,并逆轉(zhuǎn)CPA對(duì)p-Jak2的抑制作用。 小結(jié)糖氧剝奪基礎(chǔ)后,A1R通過Akt磷酸化抑制膠質(zhì)化反應(yīng),且Akt與Jak2信號(hào)通路間存在crosstalk。 第二部分腺苷A2a受體在反應(yīng)性膠質(zhì)化中的作用及其機(jī)制 目的研究體外糖氧剝奪后,A2aR在反應(yīng)性膠質(zhì)化中的作用及相關(guān)的信號(hào)通路(Akt/NF-κB)。 方法將真核表達(dá)質(zhì)粒pEYFP-A2aR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至RBA-2細(xì)胞中,篩選出A2aR高表達(dá)克隆(A2aR~+細(xì)胞):采用Western blot和FACS,分別檢測(cè)A2aR~+細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的RBA-2細(xì)胞(A2aR~-細(xì)胞)GFAP表達(dá)和細(xì)胞周期。A2aR的抑制劑Sch58261,Akt抑制劑單獨(dú)使用或二者合用后,觀察A2aR~+細(xì)胞的GFAP表達(dá)和細(xì)胞周期;用Western Blot檢測(cè)Sch58261對(duì)Akt信號(hào)通路的影響,并觀察阻斷Akt后,Sch58261對(duì)GFAP表達(dá)、細(xì)胞周期以及NF-κB信號(hào)通路的影響。 結(jié)果Western blot和FACS結(jié)果顯示,在常氧和糖氧剝奪條件下A2aR轉(zhuǎn)染均可使GFAP表達(dá)上調(diào)以及S期細(xì)胞比例增加,該作用在糖氧剝奪后更明顯。A2aR阻斷劑Sch58261可抑制GFAP蛋白表達(dá)并降低S期細(xì)胞比例,Sch58261還可呈劑量依賴性上調(diào)p-Akt水平;阻斷Akt可逆轉(zhuǎn)Sch58261對(duì)GFAP蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期的影響。Western blot結(jié)果還顯示,Sch58261下調(diào)A2aR~+細(xì)胞胞漿中的P65但上調(diào)胞核中P65水平,且A2aR~+細(xì)胞胞漿中p-IκBα/IκBα比值減小,Akt抑制劑可逆轉(zhuǎn)Sch58261對(duì)P65和p-IκBα/IκBα的影響。 小結(jié)糖氧剝奪后,A2aR通過Akt去磷酸化誘導(dǎo)膠質(zhì)化反應(yīng),該過程與P65蛋白的核轉(zhuǎn)位有關(guān),而后者受p-IκBα/IκBα比值調(diào)控。 第三部分腺苷A1與A2a受體之間的相互作用及其相關(guān)的信號(hào)通路 目的研究體外糖氧剝奪后,A1R與A2aR之間的相互作用,并對(duì)該作用所涉及的信號(hào)通路進(jìn)行初步探討。 方法培養(yǎng)A2aR~+細(xì)胞,采用免疫共沉淀的方法,定性檢測(cè)A1R與A2aR間的相互作用;采用Western blot方法,檢測(cè)糖氧剝奪后A1R拮抗劑DPCPX對(duì)A2aR以及GFAP表達(dá)的影響并初步探討該作用所涉及的信號(hào)通路(Jak2、Akt)。 結(jié)果免疫共沉淀結(jié)果顯示A1R與A2aR間存在相互作用;Western blot結(jié)果顯示糖氧剝奪后,A1R拮抗劑DPCPX呈劑量依賴性上調(diào)A2aR以及GFAP蛋白表達(dá);DPCPX還可抑制A2aR~+細(xì)胞中p-Akt以及p-Jak2水平。 小結(jié)Akt與Jak2信號(hào)分子可能參與調(diào)節(jié)A1R與A2aR間存在相互作用。 結(jié)論 1.體外糖氧剝奪后,A1R通過Akt磷酸化進(jìn)而抑制膠質(zhì)化。抑制Akt可上調(diào)p-Jak2。提示Akt可能通過p-Jak2介導(dǎo)A1R抑制膠質(zhì)化。 2.體外糖氧剝奪后,A2aR通過Akt去磷酸化誘導(dǎo)膠質(zhì)化反應(yīng),該過程與P65蛋白的核轉(zhuǎn)位有關(guān),而后者受p-IκBα/IκBα調(diào)節(jié),提示A2aR可能通過Akt/NFκB信號(hào)通路誘導(dǎo)反應(yīng)性膠質(zhì)化。 3.A1R與A2aR存在相互作用,阻斷A1R可上調(diào)A2aR蛋白表達(dá),還可下調(diào)p-Akt與p-Jak2水平,提示Akt與Jak2信號(hào)分子可能參與調(diào)節(jié)這兩種受體間的相互作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉穎;陸錦標(biāo);陳琦;葉諸榕;;MAPK/ERK激酶-ERK信號(hào)通路參與外源性bFGF對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Egr-1結(jié)合活性的調(diào)節(jié)(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2007年04期

2 孫景軍;劉穎;葉諸榕;;P2Y_1受體對(duì)缺血狀態(tài)下星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生膠質(zhì)原纖維酸性蛋白與膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響及相關(guān)信號(hào)通路(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2008年04期

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本文編號(hào)：1565229