本文選題：有機(jī)磷農(nóng)藥　切入點(diǎn)：單克隆抗體　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：依據(jù)二甲氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的共有結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)了含有二甲氧基硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)和苯環(huán)結(jié)構(gòu)的通用半抗原,即3-[4-(O,O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸(Hapten1, H1)。采用活潑酯法分別將H1與牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)合成免疫原和包被原。將制備好的免疫原H1-BSA,免疫6-8周齡雌性BALB/c鼠,每次每只小鼠的免疫原用量100μg。以HI-OVA作為包被原,用非競(jìng)爭(zhēng)間接酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)多次免疫后的小鼠血清效價(jià)并選擇效價(jià)較高的小鼠用于細(xì)胞融合。采用PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,建立可穩(wěn)定分泌抗二甲氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)ELISA法篩選及有限稀釋法亞克隆,成功建立了兩株對(duì)甲基對(duì)硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲基立枯磷、殺螟硫磷和馬拉硫磷六種二甲氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥具有明顯的識(shí)別作用的雜交瘤細(xì)胞株(D12-B5、E5-H2)。通過(guò)體內(nèi)與體外培養(yǎng)大量制備單克隆抗體,并經(jīng)鹽析、蛋白親和層析獲得純度較高的抗體。用非競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA法檢測(cè)效價(jià),非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定親和力,競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA法測(cè)定抗體的特異性。選效價(jià)較高的雜交瘤細(xì)胞株D12-B5為研究對(duì)象,用小鼠亞型分析試劑盒測(cè)定出所分泌的抗體為IgG1、κ型,親和常數(shù)達(dá)1.709×109L/mol。以H1-OVA作為包被原,采用競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA法測(cè)定出抗體對(duì)甲基對(duì)硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲基立枯磷、殺螟硫磷和馬拉硫磷六種農(nóng)藥的150分別為42.1μg/mL、60.2μg/mL、75μg/mL、13.58μg/mL、117μg/mL和172.9μg/mL。 為了分析不同結(jié)構(gòu)的異源包被原對(duì)抗體檢測(cè)靈敏度的影響,將與甲基對(duì)硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷和殺螟硫磷結(jié)構(gòu)相似的半抗原用活潑酯法與OVA偶聯(lián)形成不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的異源包被原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與分析物(農(nóng)藥)的結(jié)構(gòu)相似的異源半抗原并不能提高單克隆抗體對(duì)該農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度,但寬譜性抗體與H7-OVA的組合可使甲基對(duì)硫磷和甲基毒死蜱競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA的150值分別可達(dá)到0.58μg/mL、0.81μg/mL。 根據(jù)以上異源包被原的分析結(jié)果選擇H7-OVA作為包被原,采用矩陣滴定法確定抗原抗體的最佳組合,通過(guò)對(duì)離子強(qiáng)度、pH值等影響因子的研究,確定ELISA的最佳工作參數(shù),建立定量測(cè)定的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。通過(guò)ELISA條件優(yōu)化,確定了甲基對(duì)硫磷和甲基立枯磷的ELISA的最佳工作條件,建立了定量測(cè)定甲基對(duì)硫磷和甲基立枯磷的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,甲基對(duì)硫磷的150和檢測(cè)限(120)分別為0.165μg/mL、0.0144μg/mL,甲基立枯磷的150和檢測(cè)限(120)分別為0.95μg/mL、0.033μg/mL。 在此基礎(chǔ)上,選擇效價(jià)較高的小鼠脾細(xì)胞和較高親和力的雜交瘤細(xì)胞株,提取總RNA,用鼠類重鏈、輕鏈可變區(qū)通用引物,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR,擴(kuò)增兩種細(xì)胞可變區(qū)基因。通過(guò)重疊延伸PCR (SOE-PCR)將可變區(qū)基因通過(guò)連接肽基因連接起來(lái),構(gòu)建單鏈抗體基因,克隆到T載體中,通過(guò)PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。其結(jié)果顯示從小鼠脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞中成功地?cái)U(kuò)增到了重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,大小在300 bp左右；采用SOE-PCR獲得約750 bp大小的單鏈抗體基因,并克隆到T載體。經(jīng)測(cè)序證實(shí),輕重鏈可變區(qū)基因均符合小鼠可變區(qū)基因的特征,輕重鏈之間是由45 bp連接肽基因連接。 在Discovery Studio軟件服務(wù)器上,利用同源蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法模建單鏈抗體三維結(jié)構(gòu)模型,并驗(yàn)證了三維結(jié)構(gòu)的合理性。從構(gòu)建的單鏈抗體(ScFv)三維結(jié)構(gòu)模型中看出,單鏈抗體的輕、重鏈的超可變區(qū)(CDR)均暴露在抗體結(jié)構(gòu)的表面,并形成桶狀結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)非常有利于抗體與抗原的結(jié)合。單鏈抗體三維模型的模建為進(jìn)一步分析輕、重鏈在抗體功能中的作用,為改造抗體、提高抗體活性等方面奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1556689