本文選題：CARM1　切入點(diǎn)：H3精氨酸甲基化　出處：《華東師范大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶4(Protein Arginine Methyltransferase4, PRMT4)又稱為共激活因子相關(guān)的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(Coactivator-Associated Arginine Methyltransferase1,CARM1),它催化組蛋白H3氮端的2、17和26號(hào)位,碳端的128、129、131和134號(hào)位以及H2A上的精氨酸甲基化。其中精氨酸17和26號(hào)位是該酶的主要催化位點(diǎn),并且其甲基化會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄。CARM1在細(xì)胞核激素受體(Nuclear Receptor, NR)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活中起轉(zhuǎn)錄共激活因子的作用。在激素的刺激下,初級(jí)共激活因子p160首先與NR結(jié)合,同時(shí)招募次級(jí)共激活因子PRMT1、CBP/p300和CARM1等結(jié)合到p160上。其中,PRMT1對(duì)H4R3位點(diǎn)的甲基化修飾促進(jìn)了CBP/p300對(duì)H3K14位點(diǎn)的乙酰化,反過來乙�；执龠M(jìn)了CARM1催化的H3R17位點(diǎn)的甲基化修飾,而這一位點(diǎn)的甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。此外CARM1還能結(jié)合染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄重塑復(fù)合物,增強(qiáng)其ATP酶的活性,最終激活基因的轉(zhuǎn)錄。 目前,CARM1甲基化H3R17和H3R26位點(diǎn)后如何促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的具體機(jī)制還尚不清楚。本論文則以此為出發(fā)點(diǎn),研究CARM1促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的可能機(jī)制。 為了尋找能夠與H3R17和H3R26位點(diǎn)甲基化的多肽特異性結(jié)合的效應(yīng)蛋白,我們首先在體外做了Pull-down實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)H3多肽的R17和R26兩個(gè)位點(diǎn)的精氨酸甲基化后,多肽結(jié)合核蛋白的能力顯著降低。經(jīng)質(zhì)譜分析,結(jié)合降低的蛋白有MTA1、TIFlα和TIF1γ等轉(zhuǎn)錄共抑制因子,此結(jié)果通過放射自顯影和蛋白質(zhì)免疫印記得到驗(yàn)證。根據(jù)這些結(jié)果我們推測CARM1促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制之一是降低轉(zhuǎn)錄共抑制因子與組蛋白的結(jié)合。 然后我們利用CARM1敲除型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞檢測此修飾是否也影響轉(zhuǎn)錄共抑制因子與染色質(zhì)的結(jié)合。提取野生型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和敲除型細(xì)胞的組蛋白和染色質(zhì),通過蛋白質(zhì)免疫印記檢測轉(zhuǎn)錄共抑制因子的結(jié)合狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)CARM1敲除型細(xì)胞的組蛋白和染色質(zhì)同野生型相比結(jié)合了更多的轉(zhuǎn)錄共抑制因子。 另一方面,我們又檢測了CARM1的過量表達(dá)是否能反過來降低轉(zhuǎn)錄共抑制因子與染色質(zhì)的結(jié)合。我們成功建立了可誘導(dǎo)表達(dá)CARM1的穩(wěn)定細(xì)胞系。該細(xì)胞經(jīng)鹽酸多西環(huán)素誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)后,CARM1蛋白過量表達(dá),提取誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)細(xì)胞的染色質(zhì),通過蛋白質(zhì)免疫印記檢測其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄共抑制因子。我們發(fā)現(xiàn)CARM1過量表達(dá)的細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄共抑制因子的能力確實(shí)要比未誘導(dǎo)的低。 綜上所述,我們得出CARM1促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制可能是通過R17和R26的甲基化來降低轉(zhuǎn)錄共抑制因子與染色質(zhì)的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:Arginine methyltransferase 4 protein Arginine Methyltransferase4 (PRMT4), also known as the arginine methyltransferase associated with coactivator, Coactivator-Associated Arginine methyltransferase1 (CARM1), catalyzes the N-terminal of histone H3 at 2G17 and 26. Arginine methylation at the carbon terminal sites 128,129,131 and 134 and the arginine methylation on the H2A site. The arginine 17 and 26 sites are the main catalytic sites of the enzyme. And its methylation may affect the transcription of genes. CARM1 acts as a transcription co-activator in nuclear receptor nuclear receptor (NR1) -mediated transcriptional activation. Under hormone stimulation, primary co-activator p160 binds to NR first. At the same time, the secondary co-activator PRMT1CBP / p300 and CARM1 were recruited to bind to p160. the methylation of H4R3 site by PRMT1 promoted the acetylation of H3K14 site by CBP/p300, which in turn promoted the methylation of H3R17 site catalyzed by CARM1. The methylation of this site is related to the transcriptional activation of the gene. In addition, CARM1 can bind to the chromatin transcriptional remodeling complex, enhance the activity of its ATP enzyme, and finally activate the transcription of the gene. At present, it is not clear how to promote gene transcription after methylation of CARM1 at H3R17 and H3R26 sites. This paper studies the possible mechanism of CARM1 promoting gene transcription. In order to find the effector proteins that can specifically bind to the methylated peptides at H3R17 and H3R26 sites, we first performed Pull-down experiments in vitro. We found that the arginine methylation of the R17 and R26 sites of H3 peptides was performed in vitro. The ability of peptide binding nucleoprotein was significantly decreased. By mass spectrometric analysis, the reduced proteins included transcriptional co-inhibitory factors such as MTA1TIFl 偽 and TIF1 緯. The results were verified by autoradiography and protein-immunological imprinting. Based on these results, we speculate that one of the molecular mechanisms of CARM1 promoting gene transcription is to reduce the binding of transcription co-suppressor to histone. Then we used CARM1 knockout mouse embryonic fibroblasts to detect whether the modification also affected the binding of transcription co-suppressor to chromatin. We extracted histone and chromatin from wild mouse embryonic fibroblasts and knockout cells. We found that the histone and chromatin of CARM1 knockout cells combined more transcription co-suppressive factors than wild-type cells. On the other hand, We also examined whether overexpression of CARM1 could in turn reduce the binding of transcription co-suppressor to chromatin. We successfully established a stable cell line that could induce the expression of CARM1. The cell line was induced by doxycycline hydrochloride for 6 small cells. Overexpression of CARM1 protein, The chromatin binding ability of the cells with CARM1 overexpression was lower than that of the uninduced cells. In conclusion, we conclude that the molecular mechanism of CARM1 promoting gene transcription may be through the methylation of R17 and R26 to reduce the binding of transcription co-suppressor and chromatin.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R3411

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1556549