本文關鍵詞： GFP-V12Rac1 慢病毒載體 NIH3T3細胞 穩(wěn)定表達 細胞遷移　出處：《南京醫(yī)科大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： Rac1的活性在運動細胞中往往呈現(xiàn)前端富集,這一定位模式對于細胞運動的實現(xiàn)有著重要作用,但此定位的機制尚未完全闡明,要對此定位的機制展開深入研究,首先需要建立穩(wěn)定表達GFP-V12Rac1的NIH3T3細胞系。本研究在構建GFP-V12Rac1和GFP的質粒和慢病毒表達載體的基礎上,采用慢病毒感染和流式細胞術分選的方法構建穩(wěn)定表達GFP和GFP-V12Rac1的NIH3T3小鼠成纖維細胞系。我們通過流式細胞術檢測穩(wěn)定表達細胞系的目的基因陽性率和表達水平;通過7-AAD和APC Annexin V雙染和流式細胞術檢測的方法確認表達GFP-V12Rac1的NIH3T3細胞在血清饑餓條件下的生存能力;通過觀察細胞在I型膠原上的鋪展和細胞質膜皺褶形成來判斷外源表達GFP-V12Rac1融合蛋白是否具備正常功能,通過細胞遷移實驗研究細胞的自發(fā)運動和趨化運動能力,同時初步檢測了運動細胞中GFP-V12Rac1的定位。流式細胞術檢測結果顯示,穩(wěn)定表達GFP和GFP-V12Rac1的NIH3T3細胞系在多次傳代后仍然保持目的基因的高陽性率,且兩個細胞系的平均GFP熒光強度均顯著高于背景熒光強度;7-AAD和APC Annexin V雙染結果顯示,血清饑餓12h,外源GFP-V12Rac1不影響細胞的生存能力;鋪展實驗和活細胞工作站觀測表明,外源GFP-V12Rac1具備促進細胞鋪展和細胞質膜皺褶的能力;細胞遷移實驗證實,細胞具備趨化運動能力。劃痕實驗結果提示,劃痕引發(fā)的細胞運動中,少數(shù)細胞出現(xiàn)了GFP-V12Rac1的前端定位。本研究結果表明,慢病毒感染和流式細胞術分選是構建NIH3T3穩(wěn)定表達細胞系的有效途徑,外源表達的GFP-V12Rac1具備正常功能,構建的細胞系可用于對運動細胞中活化的Rac1進行定位觀察。
[Abstract]:The activity of Rac1 tends to be preferentially enriched in the motor cells. This localization model plays an important role in the realization of cell movement. However, the mechanism of this localization has not been fully clarified, and the mechanism of this localization should be deeply studied. Firstly, we need to establish a stable NIH3T3 cell line expressing GFP-V12Rac1. Based on the construction of GFP-V12Rac1 and GFP plasmids and lentivirus expression vectors, The fibroblasts of NIH3T3 mice expressing GFP and GFP-V12Rac1 stably were constructed by lentivirus infection and flow cytometry. The positive rate and expression level of target genes in stable expression cell lines were detected by flow cytometry. The viability of NIH3T3 cells expressing GFP-V12Rac1 was confirmed by using 7-AAD and APC Annexin V double staining and flow cytometry. The expression of GFP-V12Rac1 fusion protein was evaluated by observing cell spreading on type I collagen and the formation of cytoplasmic membrane fold. The ability of spontaneous and chemotaxis of cells was studied by cell migration experiment. At the same time, the localization of GFP-V12Rac1 in motor cells was preliminarily detected. The results of flow cytometry showed that the NIH3T3 cell lines stably expressing GFP and GFP-V12Rac1 maintained the high positive rate of the target gene after repeated passages. The average GFP fluorescence intensity of the two cell lines was significantly higher than that of background fluorescence intensity 7-AAD and APC Annexin V. The results showed that exogenous GFP-V12Rac1 did not affect the viability of the cells after 12h of serum starvation. Exogenous GFP-V12Rac1 has the ability to promote cell spreading and cytoplasmic membrane fold. Cell migration experiments have proved that cells have chemotaxis ability. The results of scratch test suggest that in the cell movement induced by scratch, The results of this study indicate that lentivirus infection and flow cytometry are effective ways to construct stable expression cell lines of NIH3T3, and exogenous GFP-V12Rac1 has normal function. The constructed cell line can be used to localize activated Rac1 in motor cells.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 孔凡銘;張新偉;于津浦;魏楓;李慧;任秀寶;;iASPP真核表達載體的構建及其對NIH3T3細胞增殖的影響[J];天津醫(yī)科大學學報;2011年02期

2 ;[J];;年期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關會議論文 前10條

1 張巧;謝惠玲;符君;高麗霞;徐紅輝;程書鈞;;Rap2b基因高表達對NIH3T3細胞P38MAPK通路的影響[A];經濟發(fā)展方式轉變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國科學技術協(xié)會年會（第三卷）[C];2010年

2 楊勁松;鄭新民;陳詩書;;利用基因芯片技術篩選PTPa誘導后NIH3T3細胞中差別表達的基因[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術會議論文摘要集[C];2001年

3 李孟森;李平風;楊非易;杜國光;李剛;;甲胎蛋白對NIH3T3細胞和人肝癌Bel7402細胞增殖的促進作用[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術會議論文摘要集[C];2001年

4 張巧;邢瑞婷;徐紅輝;袁勁松;李春陽;吳衛(wèi)東;吳逸明;程書鈞;;Rap2b基因真核表達載體構建及其對NIH3T3細胞P38通路的影響[A];中國環(huán)境誘變劑學會致癌專業(yè)委員會09年學術會議論文匯編[C];2009年

5 高麗霞;張巧;吳衛(wèi)東;樊劍鳴;吳逸明;程書鈞;;rap2b基因真核表達載體構建及其對NIH3T3細胞通路的影響[A];第十屆中國科協(xié)年會論文集（三）[C];2008年

6 高麗霞;張巧;徐紅輝;吳衛(wèi)東;樊劍鳴;吳逸明;程書鈞;;rap2b基因真核表達載體構建及其對NIH3T3細胞通路的影響[A];中國科學技術協(xié)會第十屆年會21分會場論文匯編[C];2008年

7 邢瑞婷;張巧;徐紅輝;吳衛(wèi)東;徐玉寶;吳逸明;程書鈞;;PcDNA3.1-rap2b表達載體對NIH3T3細胞表型影響[A];第十屆中國科協(xié)年會論文集（三）[C];2008年

8 邢瑞婷;張巧;徐紅輝;吳衛(wèi)東;徐玉寶;吳逸明;程書鈞;;PcDNA3.1-rap2b表達載體對NIH3T3細胞表型影響[A];中國科學技術協(xié)會第十屆年會21分會場論文匯編[C];2008年

9 弋峰;于建;郭朝霞;;可溶性雞蛋殼膜蛋白的制備及其生物相容性[A];2004年全國高分子材料科學與工程研討會論文集[C];2004年

10 王珍祥;李世榮;吳軍;易紹萱;;反義及正義α-SMA的表達影響成纖維細胞與平滑肌細胞的實驗研究[A];中國康復醫(yī)學會修復重建外科專業(yè)委員會第十四次全國學術交流會論文集[C];2004年

相關博士學位論文 前10條

1 張梅英;pTet-on和pTRE2-H-Ins雙質粒穩(wěn)定整合小鼠胚胎干細胞系的建立[D];中國醫(yī)科大學;2005年

2 劉珠果;表達SARS冠狀病毒受體hACE2的SARS易感小鼠模型的建立[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2008年

3 李小明;mTOR基因轉染對NIH3T3成纖維細胞增殖的影響及其作用機制研究[D];中南大學;2008年

4 韓焱福;微囊化VEGF基因修飾細胞移植促進脫細胞真皮血管化的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2008年

5 劉瑩;NIH3T3細胞中PKC通過MPF影響G2/M期進程[D];中國醫(yī)科大學;2002年

6 趙繼敏;PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路調控DNA polβ表達在食管癌中的作用[D];鄭州大學;2009年

7 栗向東;人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉染成纖維細胞后的穩(wěn)定表達和誘導成骨的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2000年

8 閭軍;HPO-205與EDAG基因的克隆與功能研究[D];浙江大學;2002年

9 陳濤涌;來源于人樹突狀細胞的新型癌基因樣小G蛋白RabJ的生物學功能研究[D];第二軍醫(yī)大學;2004年

10 季樹英;粘著斑激酶對β1，，4-半乳糖基轉移酶Ⅰ的表達和活性調控[D];復旦大學;2003年

相關碩士學位論文 前10條

1 王樂;穩(wěn)定表達GFP-V12Rac1的NIH3T3細胞系的構建[D];南京醫(yī)科大學;2010年

2 楊文玖;腫瘤壞死因子-α對NIH3T3細胞成熟化作用的實驗研究[D];青島大學;2010年

3 賁松彬;bFGF對NIH3T3細胞TPK、PKC及ERK活性的影響[D];中國醫(yī)科大學;2002年

4 朱涵;互隔交鏈孢酚對NIH3T3細胞中DNA聚合酶β基因的致突變作用[D];鄭州大學;2005年

5 陳中華;多種抗氧化劑對NIH3T3細胞紫外損傷的保護作用研究[D];山東理工大學;2008年

6 張曉紅;M-CSF在NIH3T3細胞核內的表達及其對細胞運動的影響[D];南華大學;2006年

7 廖銀花;siRNA抑制STGC3基因表達對NIH3T3細胞增殖的影響[D];南華大學;2007年

8 郝天智;AP-1圈套寡核苷酸抑制NIH3T3細胞膠原表達的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2002年

9 牛靜;野生型DNA聚合酶β轉染對細胞應對交鏈孢霉酚損傷作用的影響[D];鄭州大學;2006年

10 李其滿;EphA3基因穩(wěn)定表達細胞模型的建立[D];福建農林大學;2009年

本文編號：1544896